紫紅素與氟康唑影響白念珠菌生物膜形成的比較.pdf

1、目的:
　　本實驗擬通過體外構建白念珠菌生物膜的可重復模型，觀察分析紫紅素和氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ば螒B(tài)結構及線粒體的影響，并從基因角度檢測黏附相關基因ALS1、ALS4、EFG1和HWP1的表達水平變化，以期初步探索紫紅素對白念珠菌生物膜黏附過程的抑制機制。
　　方法:
　　1.白念珠菌生物膜構建及鑒定:
　　選擇白念珠菌標準株ATCC90028體外構建生物膜模型，利用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及激光共聚焦顯微鏡觀

2、察生物膜的形態(tài)結構，并通過XTT減低法測定白念珠菌生物膜的動力生長曲線，明確生長對數(shù)期及衰亡期。
　　2.紫紅素和氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ば纬蛇^程的影響:
　　通過XTT減低法和細胞毒性實驗確定紫紅素的最佳作用濃度，并通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及激光共聚焦顯微鏡三種方法觀察藥物作用后生物膜的結構變化情況。
　　3.紫紅素和氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ゐじ竭^程的影響:
　　倒置相差顯微鏡下觀察紫紅素和氟康唑?qū)︷じ竭^程的影

3、響;利用稱量干重的方法、基因檢測ALS1、ALS4、EFG1和HWP1表達水平的變化定量分析紫紅素和氟康唑?qū)︷じ竭^程的影響，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察紫紅素和氟康唑?qū)ι锬ぞ€粒體的影響，初步探索黏附作用機制。
　　結果:
　　1.白念珠菌生物膜的體外模型穩(wěn)定且可重復性高，鏡下生物膜呈典型的網(wǎng)狀結構，0.01％結晶紫染色后可見菌絲結構及胞外基質(zhì)。白念珠菌生物膜的動力生長曲線基本呈“S”型，對數(shù)生長期大約為12～48h，穩(wěn)定期為

4、48～60h為，60h后開始進入衰亡期。
　　2.XTT減低法和細胞毒性實驗確定紫紅素最佳作用濃度為20μg/mL，該濃度既能達到良好的抑制作用，又不致于對人體正常成纖維細胞造成傷害;倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及激光共聚焦顯微鏡下可觀察到不同濃度紫紅素和氟康唑作用后生物膜的形態(tài)，20μg/mL紫紅素作用后的生物膜不能形成正常的菌絲且結構松散、胞外基質(zhì)幾乎沒有。
　　3.倒置相差顯微鏡下20μg/mL紫紅素作用2h的生物膜細胞量

5、少于128μg/mL氟康唑組及正常對照組;作用48后，經(jīng)消化離心、干燥后的生物膜重量，同樣是20μg/mL紫紅素組干重量最低，與其余兩組相比P值均小于0.05;基因ALS1、ALS4、EFG1和HWP1的表達量卻高于128μg/mL氟康唑組，低于正常對照組，兩兩比較所得P值均小于0.05;激光共聚焦顯微鏡下，紫紅素作用后生物膜中線粒體的活性明顯減弱。
　　結論:
　　1.白念珠菌標準株ATCC90028可在體外形成生物膜結構