饑餓狀態(tài)對白色念珠菌生物膜滯留菌的影響及滯留菌相關基因的單細胞分析.pdf

1、目的：
　　作為人類最常見的條件致病菌——白色念珠菌（Candidaalbicans），所引起的感染性疾病大都是慢性和難治性的，這與其形成的生物膜結構密切相關。白色念珠菌生物膜高耐藥性的可能機制有:生物膜基質對藥物的空間位阻和屏障作用;生物膜中白色念珠菌的特殊生長狀態(tài)，例如遲緩生長狀態(tài);基因水平的耐藥機制;生物被膜內細胞質膜脂質成分的影響;以及近幾年提出的‘滯留菌’的產(chǎn)生等等。越來越多的研究提示，正是滯留菌(Persisters)

2、的存在，使得藥物無法完全清除白色念珠菌生物膜，對慢性遷延性感染的產(chǎn)生起到了關鍵性的作用。
　　已有研究證實了細菌滯留菌的產(chǎn)生機制主要包括以下2個方面:微生物群體中生長速度的異質性，極少數(shù)生長處于靜止狀態(tài)的菌細胞亞群成為滯留菌;饑餓等環(huán)境因素導致的SOS反應，即極端不利環(huán)境因素誘導。這表明滯留菌的產(chǎn)生機制，并非單一的由生長狀態(tài)異質性造成的，而是與環(huán)境因素的誘導也有密切關系。那么，改變生物膜代謝的營養(yǎng)環(huán)境，是不是也會對白色念珠菌耐藥滯

3、留菌的產(chǎn)生有一定的影響呢？
　　本實驗即通過研究饑餓環(huán)境對白色念珠菌生物膜以及其耐藥滯留菌形成的影響，證實白色念珠菌生物膜耐藥滯留菌形成的第二種機制（環(huán)境因素影響機制）;并且，進一步運用基于Taqman探針的單細胞real-timeRT-PCR技術相對定量檢測滯留菌相關基因，為今后白色念珠菌耐藥滯留菌相關基因的研究提供方便、可行的研究技術。
　　材料和方法：
　　(1)饑餓狀態(tài)對白色念珠菌生物膜及其耐藥滯留菌形成的影響

4、
　　體外分別構建對數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓狀態(tài)白色念珠菌生物膜模型，兩性霉素B(AmB)沖擊作用24h，沖擊前后均進行活菌菌落計數(shù)(CFU)，計算得出滯留菌比例并進行統(tǒng)計學分析，同時通過共聚焦顯微鏡觀察和分析各組生物膜的形成狀況。
　　(2)基于Taqman探針的單細胞real-timeRT-PCR技術相對定量檢測滯留菌相關基因的表達水平
　　倒置顯微鏡下，使用自行拉制的分離微吸管吸取非滯留菌細胞和滯留菌細胞，進行基于Ta

5、qman探針的單細胞real-timeRT-PCR，相對定量檢測白色念珠菌生物膜耐藥滯留菌EFG1、ERG2、MKC1、GIN4基因的表達水平，采用SPSS11.70軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　(1)對數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓狀態(tài)白色念珠菌生物膜的形成能力依次下降(P＜0.05)，具有顯著性差異，對數(shù)期和穩(wěn)定期白色念珠菌生物膜形成的為菌絲相生物膜，而饑餓態(tài)白色念珠菌形成的為酵母相生物膜。藥物作用后滯留菌比例依次上

6、升(P＜0.05)。
　　(2)基于Taqman探針的單細胞real-timeRT-PCR技術相對定量地檢測出了白色念珠菌滯留菌中EFG1、ERG2、MKC1、GIN4的表達水平。其中，除了MKC1在滯留菌細胞和非滯留菌細胞中的表達水平無顯著性差異(P＞0.05)外，EFG1、ERG2、GIN4在滯留菌中的表達水平明顯升高(P＜0.05），具有顯著性差異。
　　結論：
　　(1)營養(yǎng)狀態(tài)對白色念珠菌滯留菌的產(chǎn)生有影響，

7、饑餓狀態(tài)能夠提高滯留菌的產(chǎn)生比例，提示白色念珠菌耐藥滯留菌形成與營養(yǎng)狀態(tài)等環(huán)境因素有關。
　　(2)自制的分離微吸管能夠成功分離出滯留菌細胞，在此基礎上，基于Taqman探針的單細胞real-timeRT-PCR技術是快速檢測滯留菌相關基因表達水平的有效方法，為今后研究白色念珠菌滯留菌相關基因提供了方便、可行的研究技術。
　　(3)白色念珠菌滯留菌的形成與基因EFG1、ERG2以及GIN4均密切相關，并非由單一的信號通路決定