柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜的體外抑制作用.pdf

1、口腔念珠菌病是口腔粘膜真菌性感染的常見疾病，主要為白色念珠菌感染。白色念珠菌是一種廣泛寄居在宿主體內(nèi)的條件致病真菌，在機(jī)體正常免疫的情況下，一般不發(fā)病，但當(dāng)宿主免疫力降低，機(jī)體平衡系統(tǒng)被打破時(shí)，白色念珠菌則會(huì)引起機(jī)會(huì)性感染。目前由于免疫抑制劑、激素和抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，機(jī)體菌群失調(diào)隨之越來(lái)越普遍，白色念珠菌機(jī)會(huì)性感染率日益上升，發(fā)病率逐年升高。由于傳統(tǒng)抗真菌藥物的使用以及白色念珠菌生物膜的形成，導(dǎo)致其耐藥性逐步增強(qiáng)，耐藥機(jī)制越來(lái)越

2、復(fù)雜，從而增加了生物膜相關(guān)性感染的治療難度。目前能有效治療且不引起相關(guān)臟器損傷的抗真菌藥物極為有限，因而越來(lái)越多的研究者試圖從中草藥中尋找新型抗真菌藥物應(yīng)用于臨床，或與傳統(tǒng)抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，開辟除了傳統(tǒng)抗真菌藥物治療的另一片治療天地。鞣質(zhì)于植物界中廣泛存在，大部分生藥中均含有鞣質(zhì)類化合物，其具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤和癌變等作用，且毒副作用小，易于提取。柿子中鞣質(zhì)含量較高，在我國(guó)被廣泛種植，產(chǎn)量豐富。因此本研究使用經(jīng)乙醇超聲提取而出的柿

3、鞣質(zhì)水提取液，采用XTT還原比色法，觀察柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜的體外抑制作用，為臨床治療白色念珠菌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：在體外構(gòu)建白色念珠菌生物膜的模型，對(duì)其進(jìn)行抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，以生物膜形式存在的白色念珠菌菌株對(duì)傳統(tǒng)用藥均表現(xiàn)出高度耐藥性，所以臨床治療白色念珠菌感染有很大難度。鞣質(zhì)能凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)并作用于多種酶，能抑制多種病菌生長(zhǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)研究了柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜的體外抑制作用，

4、進(jìn)一步了解柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜的影響。
　　方法：
　　1、柿鞣質(zhì)的提取
　　對(duì)蓋柿全柿果實(shí)打碎研磨，乙醇浸泡后進(jìn)行超聲提取，濃縮液經(jīng)蒸餾水稀釋，AB-8大孔樹脂吸附除糖，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使用聚砜中空纖維超濾膜超濾，獲得的柿鞣質(zhì)溶液的分子量為10000，利用Folin-Denis法測(cè)定其鞣質(zhì)的含量。取全柿鞣質(zhì)水提取液，使用0.22μm濾菌器過(guò)濾除菌，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br>　　2、白色念珠菌生物膜的制備

5、　　將白色念珠菌接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，離心采集菌體， PBS洗滌菌體2~3次，以 RPMI-1640培養(yǎng)基配成濃度為1x106cfu· mL-1的標(biāo)準(zhǔn)菌液。將100μL標(biāo)準(zhǔn)菌液接種于96孔培養(yǎng)板中，另加RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足體積至200μL，37℃靜置培養(yǎng)24h，形成生物膜結(jié)構(gòu)。倒置顯微鏡下觀察白色念珠菌生物膜的形成。
　　3、柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜的影響
　　采用XTT還原比色法觀察柿鞣

6、質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌成膜的影響，評(píng)估不同濃度的柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)不同時(shí)間白色念珠菌的藥敏性，倒置顯微鏡觀察藥物作用后白色念珠菌生物膜的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1、柿鞣質(zhì)水提取液的鞣質(zhì)含量為7.42 mg/mL。
　　2、柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌生物膜形成以及菌絲態(tài)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用(P<0.05)，其作用與藥物濃度呈正相關(guān)，其中3.7100 mg/mL和1.8550 mg/mL柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)白色念珠菌

7、生物膜形成的抑制率超過(guò)90％。
　　3、柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)不同時(shí)間白色念珠菌的藥物敏感性不完全一致，高濃度柿鞣質(zhì)水提取液(3.7100 mg/mL和1.8550 mg/mL)對(duì)不同時(shí)間白色念珠菌生物膜的抑制率均大于90%，中低濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.9275 mg/mL，0.4638 mg/mL，0.2319 mg/mL，0.1159 mg/mL)同一濃度的條件下，隨著白色念珠菌生物膜的成熟，柿鞣質(zhì)水提取液對(duì)其的抑制率有下降趨勢(shì)(P