紫檀茋抗白念珠菌生物被膜的作用及自噬影響生物被膜的機(jī)制研究.pdf

1、近30年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，造血干細(xì)胞及器官移植、免疫抑制劑的大量應(yīng)用、癌癥病人的放療及化療、廣譜抗生素的大量使用、各種內(nèi)置生物材料的應(yīng)用及艾滋病的蔓延，侵襲性真菌感染的發(fā)病率及死亡率在全球呈顯著上升趨勢(shì)，真菌感染日益引起人們關(guān)注。各種侵襲性真菌感染中以白念珠菌的感染發(fā)生率最高，一方面臨床上有效的抗白念珠菌的藥物非常有限，另一方面由于白念珠菌自身的特性容易在一些生物材料表面形成生物被膜(biofilm)，給臨床治療帶來(lái)一大挑戰(zhàn)。

2、而生物被膜對(duì)大多數(shù)現(xiàn)有的抗真菌藥物都表現(xiàn)出高度耐藥的特點(diǎn)，內(nèi)置生物材料表面一旦形成生物被膜，就會(huì)容易引起反復(fù)感染并最終導(dǎo)致治療的失敗。因此，尋找新型的抗白念珠菌藥物以及有效的抗生物被膜的藥物顯得意義重大。
　　我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)紫檀芪(pterostilbene，PTE)具有很好的抗生物被膜活性，同時(shí)PTE是白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)類似物，而白藜蘆醇是廣泛應(yīng)用的很好的保健品，這也就決定了它們具有低毒的優(yōu)勢(shì)，有希望成為一個(gè)先導(dǎo)化合物，

3、來(lái)進(jìn)一步研發(fā)成抗生物被膜的藥物。因此在本課題中，為了發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗生物被膜藥物以及為后期PTE的結(jié)構(gòu)改造奠定基礎(chǔ),我們?cè)诒狙芯恐虚_(kāi)展了PTE抗白念珠菌生物被膜的構(gòu)效關(guān)系的研究。
　　我們?cè)谇捌诎l(fā)現(xiàn)PTE的抗生物被膜活性的同時(shí)，也進(jìn)行了其作用機(jī)制的探討，芯片實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PTE處理后大量自噬相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。細(xì)胞自噬現(xiàn)象最初是在20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)的，是指細(xì)胞內(nèi)受損變性或衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w或液泡中，利用其中的酶

4、進(jìn)而對(duì)這些廢棄物進(jìn)行消化降解然后進(jìn)行物質(zhì)的重新利用的一個(gè)過(guò)程。自噬是當(dāng)前的一大研究熱點(diǎn)，在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞關(guān)于自噬的研究十分成熟，而且明確了自噬在細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。但是自噬在白念珠菌中的研究才剛剛起步，而且存在爭(zhēng)議。Glen E.Palmer課題組認(rèn)為自噬對(duì)白念珠菌的生理學(xué)過(guò)程沒(méi)有意義，但是近兩年南開(kāi)大學(xué)李明春教授課題組認(rèn)為白念珠菌的自噬在其應(yīng)對(duì)各種外界刺激如氧化應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮作用

5、，同時(shí)與白念珠菌的致病力相關(guān)。關(guān)于白念珠菌自噬的文獻(xiàn)報(bào)道本來(lái)就少，而且兩課題組的觀點(diǎn)還是相悖的，那么自噬到底在白念珠菌中發(fā)揮怎樣的作用，尤其是我們用抗生物被膜的小分子化合物PTE處理后自噬相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，那么自噬在白念珠菌生物被膜中是否發(fā)揮作用，關(guān)于這部分目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，值得我們進(jìn)行深入研究。
　　在抗真菌的研究領(lǐng)域，大多數(shù)課題組都致力于發(fā)現(xiàn)新的具有抗真菌活性的小分子化合物。我們?cè)谘邪l(fā)藥物時(shí)，發(fā)現(xiàn)具有明確作用靶點(diǎn)的小分子

6、化合物才是有意義的，因此揭示小分子化合物的作用靶點(diǎn)非常重要，那么建立和優(yōu)化尋找小分子化合物藥靶的方法就有著舉足輕重的意義。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中尋找藥靶的方法很多，如同位素示蹤法、熒光光譜法、基于基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的研究方法等等，其中DARTS(drugaffinity responsive target stability)因其原理較為簡(jiǎn)單、操作步驟少，而且不需要對(duì)小分子化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到的結(jié)果更加可靠而得到科學(xué)家們的重視和廣泛應(yīng)用

7、，已有報(bào)道用這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，找到抗衰老藥物雷帕霉素和白藜蘆醇的作用靶點(diǎn)。本課題就嘗試用DARTS這個(gè)方法來(lái)進(jìn)行抗真菌藥物作用靶點(diǎn)的研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　第一部分:我們進(jìn)行了PTE抗白念珠菌生物被膜的構(gòu)效關(guān)系研究。為了方便研究，我們將PTE的結(jié)構(gòu)分成了3個(gè)部分，通過(guò)XTT法考察了RPMI1640培養(yǎng)基中PTE及28個(gè)結(jié)構(gòu)類似物的抗白念珠菌生物被膜能力（包括對(duì)生物被膜形成能力以及成熟生物被膜的影響）

8、，其中重點(diǎn)考察了與PTE結(jié)構(gòu)較接近的15個(gè)結(jié)構(gòu)類似物。我們發(fā)現(xiàn)A部分的羥基(-OH)一旦被其它取代基（包括C1-C5，B1和B2）替代，這類化合物的抗白念珠菌生物被膜的活性就消失?？梢酝茢鄬?duì)羥基(-OH)對(duì)PTE類似物的活性是重要的。B部分的雙鍵變?yōu)閱捂I(C6)時(shí)，活性變?nèi)酰砻麟p鍵有助于此類化合物的最佳活性的發(fā)揮。當(dāng)雙鍵成為呋喃環(huán)(B3)的一部分時(shí)，該化合物對(duì)生物膜具有與PTE幾乎相同的抑制活性。然而，當(dāng)雙鍵變成不飽和內(nèi)酯(C7)的一

9、部分時(shí)，或者A部分和B部分形成環(huán)狀酯(B4)時(shí)，幾乎喪失了活性。C部分的間位雙甲氧基，我們通過(guò)改變甲氧基（-OCH3）的數(shù)目或?qū)⒓籽趸?OCH3）置換成羥基(-OH)，化合物活性均變?nèi)酰砻鏖g位雙甲氧基（-OCH3）有助于維持這類化合物的最佳抗白念珠菌生物被膜活性。同時(shí)菌絲形成是生物被膜形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，我們用Spider和RPMI1640液體培養(yǎng)基中的菌絲實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了生物被膜的結(jié)果。針對(duì)Spider和RPMI1640培養(yǎng)

10、基成分的主要差異，我們還考察了Spider+2 g/Lglucose培養(yǎng)基中PTE結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌絲形成的影響，發(fā)現(xiàn)PTE、C4、C6、B3、B5和B6在這3種培養(yǎng)基均呈現(xiàn)一致的濃度依賴的菌絲抑制作用。上述結(jié)果表明對(duì)位羥基(-OH)優(yōu)于其他取代基，雙鍵和間位雙甲氧基（-OCH3）有助于維持PTE抗白念珠菌生物被膜的最佳活性。
　　第二部分:我們考查了自噬對(duì)白念珠菌生物被膜的影響。本研究中我們通過(guò)以釀酒酵母為陽(yáng)性對(duì)照，利用雷帕霉素（自

11、噬誘導(dǎo)劑）、巴弗洛霉素A1（自噬抑制劑）等工具藥和atg8△/△、ccz1△/△（caSAT1篩選標(biāo)記敲除目的基因策略）等工具菌，通過(guò)檢測(cè)一系列指標(biāo)，如相差顯微鏡下自噬小體的計(jì)數(shù)，吖啶橙(AO)染色檢測(cè)染色陽(yáng)性率以及堿性磷酸酶活性檢測(cè)，確證了白念珠菌和釀酒酵母一樣，確實(shí)存在自噬這一生理過(guò)程，而且哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自噬工具藥也適用于白念珠菌。接下來(lái)我們又用這些指標(biāo)考察了白念珠菌生物被膜中的自噬，發(fā)現(xiàn)白念珠菌生物被膜中自噬水平大大提高。Rea

12、l-Time RT PCR考察白念珠菌生物被膜中自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況，顯示自噬相關(guān)基因CCZ1、ATG1-10、ATG12、ATG13、ATG16-18和CHK1的表達(dá)均發(fā)生上調(diào)，表明生物被膜狀態(tài)的細(xì)胞自噬水平確實(shí)提高。通過(guò)XTT法考察了自噬基因敲除菌及親本菌生物被膜的形成能力，發(fā)現(xiàn)親本菌和敲除菌形成的生物被膜在24 h無(wú)明顯差異，但是在生物被膜后期48 h、72 h以及96 h時(shí)兩者形成的生物被膜存在明顯差異。利用生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、菌絲

13、形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表面疏水性實(shí)驗(yàn)考察菌株的生長(zhǎng)情況、菌絲形成能力和粘附能力，發(fā)現(xiàn)敲除菌和親本菌間三者均無(wú)明顯差異，表明兩者形成生物被膜能力的差異與生長(zhǎng)、菌絲形成以及粘附無(wú)關(guān)，與能否發(fā)生自噬相關(guān)。利用硅膠片實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步直觀的考察敲除菌和親本菌的生物被膜差異，顯示24 h時(shí)親本菌和敲除菌均能形成完整的生物被膜，但是敲除菌形成的生物被膜到48 h后更容易脫落。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)考察敲除菌和親本菌的生物被膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異，顯示親本菌和敲除菌形成的生物被膜

14、內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在明顯差異。為了更進(jìn)一步的確證結(jié)果，我們還考察了自噬抑制劑BFM在以上實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果，BFM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與敲除菌一致，表明自噬確實(shí)影響白念珠菌生物被膜的維持以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。菌液涂板實(shí)驗(yàn)考察一些臨床常用抗真菌藥物對(duì)敲除菌和親本菌形成的成熟生物被膜的抑制能力，發(fā)現(xiàn)敲除菌形成的生物被膜對(duì)常用抗真菌藥物更加敏感，表明生物被膜態(tài)細(xì)胞的耐藥性與自噬發(fā)生與否密切相關(guān)。最后我們利用線蟲(chóng)感染模型考察了敲除菌的致病力，發(fā)現(xiàn)敲除菌致病力大大下降。

15、　　第三部分:我們明確了PTE對(duì)白念珠菌生物被膜的強(qiáng)大抑制作用，并完成了初步的構(gòu)效關(guān)系研究，我們想進(jìn)一步探討PTE發(fā)揮作用的靶點(diǎn)。研究中，我們先通過(guò)優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件（包括蛋白提取，蛋白酶的種類、作用濃度和時(shí)間，跑膠條件等等），成功構(gòu)建了DARTS體系，用這個(gè)體系重復(fù)文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。即找到雷帕霉素和白藜蘆醇的差異蛋白條帶，差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析也得到了文獻(xiàn)報(bào)道的兩者的作用靶點(diǎn)FKB12和eIF4A，同時(shí)我們也用構(gòu)建的體系去成功確證了

16、抗白念珠菌陽(yáng)性藥氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LU)的藥靶。接下來(lái)我們就用改善實(shí)驗(yàn)條件的體系去尋找PTE作用的靶點(diǎn)，并嘗試進(jìn)一步提取膜蛋白以及改變分離膠的濃度去進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，期望在后續(xù)的研究中明確PTE的作用蛋白，也為今后發(fā)現(xiàn)其他抗白念珠菌小分子藥物的作用靶點(diǎn)提供了新的思路和方法。
　　總而言之，構(gòu)效關(guān)系(SAR)研究表明PTE結(jié)構(gòu)類似物抗生物被膜活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其中A部分的對(duì)位羥基（-OH）化合物表現(xiàn)出比其它取代基取代的化

17、合物更好的活性，B部分的雙鍵以及C部分的間位雙甲氧基（-OCH3）都利于此類化合物發(fā)揮最好的抗白念珠菌生物被膜的活性;作為一種機(jī)會(huì)致病菌，白念珠菌中確實(shí)存在自噬這一生理過(guò)程，同時(shí)自噬在白念珠菌生物被膜中發(fā)揮著舉足輕重的作用，即自噬在維持白念珠菌成熟生物被膜的穩(wěn)定性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)與生物被膜的高度耐藥的現(xiàn)象密切相關(guān);DARTS實(shí)驗(yàn)體系可以用于抗白念珠菌藥物的作用靶標(biāo)的找尋和確證，用該方法已成功確證了抗白念珠菌陽(yáng)性藥FLU的作