腸球菌生物膜形成特性及利奈唑胺耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.了解2012年至2014年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的腸球菌臨床分離株的臨床感染分布情況及耐藥現(xiàn)狀，為臨床控制腸球菌感染和合理使用抗菌藥物提供指導(dǎo)。
　　2.研究腸球菌生物膜形成特性及其與毒力基因的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究毒力基因作用機(jī)制及腸球菌致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　3.探討利奈唑胺非敏感腸球菌的流行特性及分子耐藥機(jī)制，為控制此類多重耐藥菌株進(jìn)一步出現(xiàn)以及在院內(nèi)傳播，延長利奈唑胺在臨床上的使用壽命提供依據(jù)

2、。
　　方法：
　　1.回顧性調(diào)查2012年至2014年臨床分離腸球菌的臨床感染分布情況;Vitek-Compact2全自動微生物分析儀及瓊脂二倍稀釋法進(jìn)行常用抗菌藥物的敏感性檢測。
　　2.結(jié)晶紫染色法測定腸球菌的生物膜形成能力并進(jìn)行形成能力的強(qiáng)弱分級，PCR方法篩查4種常見的腸球菌毒力因子基因，結(jié)合生物膜形成能力分析兩者之間的關(guān)系。
　　3.根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)篩選出利奈唑胺非敏感菌株，回顧性分析患者臨床資料;瓊

3、脂稀釋法及肉湯稀釋法測定菌株對常用抗菌藥物的敏感性;PCR擴(kuò)增其23SrRNA的V區(qū)，核糖體蛋白L3和L4基因ESPrplC和ESPrplD，并與標(biāo)準(zhǔn)敏感株及同時期分離的敏感菌株進(jìn)行核苷酸序列的Blast比較，分析基因突變與耐藥的相關(guān)性;應(yīng)用利血平及CCCP進(jìn)行外排泵表型的檢測。
　　4.利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)及多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析利奈唑胺非敏感腸球菌菌株的分子流行特點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.602株

4、腸球菌分離自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床送檢的各類標(biāo)本，其中糞腸球菌268株，占44.5％，屎腸球菌334株，占55.5％。標(biāo)本來源主要是尿液，占25.4％(153/602)，其次還包括糞便17.9％(108/602)，創(chuàng)面13.3％(80/602)，痰液10.0％(60/602)，引流液8.0％(48/602)，血液6.5％(39/602)和膿液5.1％(31/602)。糞腸球菌的主要標(biāo)本來源為尿液，占32.8％，而屎腸球菌的主要來源

5、為糞便，占28.4％。
　　2.602株腸球菌臨床分離株對大多數(shù)臨床上常用的抗菌藥物表現(xiàn)出較高的耐藥率，但對替加環(huán)素、利奈唑胺和糖肽類抗生素高度敏感。屎腸球菌對β-內(nèi)酰胺類、高水平氨基糖苷類、氟喹諾酮類的耐藥率均明顯高于糞腸球菌，而對奎奴普汀/達(dá)福普丁和四環(huán)素的耐藥率相比糞腸球菌低(P＜0.01)，其對糖肽類，利奈唑胺及替加環(huán)素的敏感性均較好，但檢測出了7株萬古霉素耐藥和7株替考拉寧非敏感的屎腸球菌。糞腸球菌對β-內(nèi)酰胺類，氟喹諾

6、酮類、糖肽類及替加環(huán)素的敏感性相對較好，但檢測出了8株利奈唑胺敏感性下降的糞腸球菌菌株。另外，在糞腸球菌中，多耐藥菌株(MDR)占13.4％，而在屎腸球菌中，多耐藥菌株的比例高達(dá)92.8％，屎腸球菌中MDR比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糞腸球菌。
　　3.348株腸球菌的毒力因子基因esp、gelE、agg和ace的檢出率由高到底分別為esp(80.5％)、agg(46.6％)、gelE(46.0％)和ace(44.3％)，除esp基因外(P=0.

7、078)，糞腸球菌中的其他3種毒力因子基因的攜帶率均顯著高于屎腸球菌(P＜0.01)。腸球菌的生物膜形成陽性率為54.6％(190/348)，其中糞腸球菌的生物膜形成陽性率為75.6％(118/156)，而屎腸球菌的生物膜形成陽性率為37.5％(72/192)。糞腸球菌毒力因子基因esp、gelE和agg的攜帶與其生物膜形成陽性率密切相關(guān)，而屎腸球菌中，只有毒力因子基因esp的攜帶與其生物膜形成陽性率密切相關(guān)(P＜0.01)。
　

8、　4.8株利奈唑胺非敏感腸球菌均為多重耐藥的糞腸球菌，僅對氨芐西林、萬古霉素和替考拉寧的敏感性較好;均攜帶至少2種毒力因子基因，且均具有生物膜形成能力;糞腸球菌23S rRNA基因的V區(qū)、核糖體蛋白L3和L4編碼基因未發(fā)生任何突變，介導(dǎo)利奈唑胺耐藥的cfr基因為陰性;利奈唑胺對糞腸球菌的MIC值在添加外排泵抑制劑（利血平和CCCP）前后均未發(fā)生明顯的改變。
　　5.PFGE結(jié)果顯示利奈唑胺非敏感糞腸球菌菌株間的同源性較小，可以分成

9、7個不相關(guān)(Unrelated)的基因型別(types A-G);MLST顯示共存在5種ST型，分別為ST16，ST49，ST586，ST587和ST588，其中4株分屬于不同PFGE基因型別菌株(TypeA、E和F)同屬于一個ST型(ST16)，而ST586，ST587和ST588為本研究中發(fā)現(xiàn)的新型ST型。
　　結(jié)論：
　　1.臨床上腸球菌主要引起泌尿系統(tǒng)感染;屎腸球菌對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率及多重耐藥菌株的比例均高于糞

10、腸球菌，臨床上在治療腸球菌引起的感染時，應(yīng)鑒定到種，并應(yīng)根據(jù)菌種間的耐藥性差異及生物膜形成特點(diǎn)來選擇相應(yīng)的合適藥物。目前，治療腸球菌感染的最佳藥物仍然是萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺。
　　2.本院分離的腸球菌具有較高的毒力基因攜帶率和生物膜形成能力，糞腸球菌的毒力基因攜帶率和生物膜形成能力均高于屎腸球菌。糞腸球菌的毒力因子基因esp、gelE和agg的攜帶與其生物膜形成密切相關(guān)，屎腸球菌的毒力因子基因esp的攜帶與其生物膜形成密切

11、相關(guān)。
　　3.本院首次檢測出8株利奈唑胺非敏感的糞腸球菌菌株，均表現(xiàn)為多重耐藥;均攜帶至少2種毒力因子基因，且均具有生物膜形成能力。菌株對利奈唑胺常見的耐藥機(jī)制均為陰性，提示存在新型耐藥機(jī)制的可能。
　　4.利奈唑胺非敏感菌株在本院內(nèi)呈散發(fā)流行，克隆傳播并不是利奈唑胺耐藥性快速上升的唯一因素。本次檢測出的3種新型ST型菌株(ST586，ST587和ST588)及利奈唑胺耐藥性可以在多種ST型中出現(xiàn)的現(xiàn)象也給其在世界范圍內(nèi)的