糞腸球菌對利奈唑胺低水平耐藥機制的實驗研究.pdf

1、目的：腸球菌是造成醫(yī)院感染的主要條件致病菌，利奈唑胺對其具有良好的抗菌活性。然而隨著利奈唑胺的廣泛使用，現(xiàn)已出現(xiàn)了對利奈唑胺耐藥的腸球菌，利奈唑胺對治療腸球菌造成的感染已面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。目前腸球菌利奈唑胺耐藥已明確的耐藥機制包括23S rRNA核糖體突變、核糖體蛋白L3，L4突變以及由多重耐藥cfr基因造成的利奈唑胺耐藥，然而有相當數(shù)量的利奈唑胺低水平耐藥腸球菌缺乏明確的耐藥機制。為探討該類腸球菌的耐藥機制，本研究首先對此類低水平耐藥糞

2、腸球菌采用利奈唑胺進行體外誘導(dǎo)，觀察該類耐藥腸球菌是否能在利奈唑胺體外誘導(dǎo)下產(chǎn)生高水平耐藥，隨后進一步深入探索利奈唑胺低水平耐藥機制，為完善利奈唑胺耐藥研究，發(fā)現(xiàn)新的耐藥靶標提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：收集5株耐藥機制不明的利奈唑胺低水平耐藥糞腸球菌，對其進行利奈唑胺體外誘導(dǎo)，觀察耐藥菌MIC值的變化。隨后采用PCR方法擴增誘導(dǎo)菌23S rRNA核糖體V區(qū)及L3，L4核糖體蛋白是否發(fā)生突變，測序結(jié)果與利奈唑胺敏感野生株ATCC292

3、12進行對比分析。誘導(dǎo)菌 V區(qū)的 G2576T突變及突變拷貝數(shù)則采用限制性內(nèi)切酶酶切及PCR擴增和測序方法檢測。采用結(jié)晶紫染色生物膜半定量試驗分析耐藥菌生物膜形成能力；用 HPLC/UV對耐藥菌利奈唑胺攝入量進行分析；采用4種常見外排泵抑制劑，包括利血平、羰基氰氯苯腙、維拉帕米及蘭索拉唑?qū)δ退幘赡艽嬖诘耐馀畔到y(tǒng)進行抑制分析；透射電鏡觀察耐藥菌細胞壁厚度的變化。
　　結(jié)果：通過利奈唑胺體外持續(xù)誘導(dǎo)，5株耐藥菌誘導(dǎo)后MIC值較原菌株

4、獲得了8~32倍增加，最高MIC值超過256 mg/L；其中有3株菌23S rRNA的V583區(qū)域發(fā)生了G2576T突變，其余2株菌未發(fā)現(xiàn)V區(qū)突變；所有誘導(dǎo)菌均未發(fā)現(xiàn) L3，L4核糖體蛋白氨基酸突變。MIC值為16 mg/L的耐藥菌比MIC為8 mg/L的耐藥菌以及ATCC29212具有更強的生物膜形成能力；4種外排泵抑制劑使用前后耐藥菌利奈唑胺MIC值無明顯改變；透射電鏡觀察細菌細胞壁厚度顯示利奈唑胺耐藥菌與敏感菌之間細胞壁厚度無明顯