金黃色葡萄球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制及其分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人體常見致病菌之一，可引起多種嚴(yán)重感染，由于耐藥金黃色葡萄球菌的廣泛流行給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。利奈唑胺作為第一個(gè)應(yīng)用于臨床的噁唑烷類抗陽(yáng)性菌藥物，被用于各種耐藥金黃色葡萄球菌感染治療，但隨著臨床廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)利奈唑胺的快速耐藥引起臨床廣泛關(guān)注。本論文對(duì)來(lái)自全國(guó)縣級(jí)醫(yī)院門診分離金黃色葡萄球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥機(jī)制及其分子基礎(chǔ)進(jìn)行了全面研究，以期對(duì)耐藥控制和臨床用藥提供依據(jù)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：收集了

2、2010年至2011年全國(guó)12個(gè)省30家縣級(jí)醫(yī)院分離的475株金黃色葡萄球菌，用稀釋法測(cè)定這些菌株對(duì)青霉素G、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧及四環(huán)素等藥物的MIC值。根據(jù)對(duì)利奈唑胺MIC水平的不同，將這些菌株進(jìn)行分組，分別在各組隨機(jī)抽取一定數(shù)量菌株進(jìn)行耐藥機(jī)制研究。應(yīng)用PCR測(cè)序法對(duì)其中36株菌株篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn

3、1-rrn6)突變點(diǎn)和利奈唑胺靶位L蛋白(L3，L4，L22)基因突變。對(duì)475株金黃色葡萄球菌篩檢cfr基因，對(duì)efr陽(yáng)性菌株檢測(cè)體外藥敏情況和進(jìn)行MLST分子分型，并篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突變點(diǎn)和利奈唑胺靶位L蛋白(L3，L4，L22)基因突變。體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，475株菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧均敏感，98.7％的菌株對(duì)磷霉素敏感，菌株對(duì)苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶

4、大霉素、環(huán)丙沙星的敏感率分別為84.7％，85.9％，87.2％，86.6％，73.2％，78.2％，而對(duì)青霉素G，克林霉素，紅霉素的敏感率僅為16.4％，48.7％，32.8％。按照CLSI臨床折點(diǎn)，沒檢出對(duì)利奈唑胺耐藥菌株。根據(jù)細(xì)菌對(duì)利奈唑胺的敏感性，將這些菌株分為5組:MIC為0.25、0.5、1、2和4μg/ml組。分別從各組選取1株，4株，10株，10株，11株，共36株菌來(lái)作進(jìn)一步研究。經(jīng)PCR和序列比對(duì)分析，共有12株菌在

5、23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)分別發(fā)生T2238C，G2398A，C2263T，C2112T，C2129T，C2219T，G2127A，C2234T，G2416A共9種核苷酸突變類型。有8株菌在分別在L3，L4或L22蛋白發(fā)生8個(gè)氨基酸突變。對(duì)475株金黃色葡萄球菌篩檢出14株cfr陽(yáng)性菌株，這些菌株利對(duì)奈唑胺的MIC為2μg/ml或4μg/ml，對(duì)替考拉寧和萬(wàn)古霉素均敏感，對(duì)氯霉素、克林霉素和紅霉素表現(xiàn)較高的耐藥性。經(jīng)PCR

6、和序列比對(duì)分析，這14株cfr陽(yáng)性菌株中有3株在23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)發(fā)生核苷酸突變，5株在L3和L4蛋白發(fā)生氨基酸突變。對(duì)這些突變點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺MIC為0.5μg/ml時(shí)，菌株在23S rRNAdomainⅤ和L蛋白均無(wú)發(fā)生突變;MIC為1μg/ml的10株菌中有4株菌在23S rRNAdomainⅤ發(fā)生核苷酸突變，無(wú)L蛋白氨基酸突變;MIC為2μg/ml的16株菌中，6株攜帶有cfr基因，有6株菌在23S r

7、RNA domainⅤ發(fā)生核苷酸突變，4株菌在L蛋白發(fā)生氨基酸突變;MIC升至4μg/ml的11株菌中有8株發(fā)現(xiàn)攜帶有cfr基因，3株在23S rRNA domainⅤ發(fā)生核苷酸突變，5株菌在L蛋白氨基酸發(fā)生突變。比較不同MIC組中的突變點(diǎn)和cfr基因發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)利奈唑胺MIC值的增高，細(xì)菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點(diǎn)數(shù)量和類型均增多，這種逐漸遞增的突變點(diǎn)數(shù)量和突變類型可能為菌株由對(duì)利奈唑胺敏感變?yōu)榕R床耐藥提供條件。
　　

8、第二部分：應(yīng)用Southem雜交確定cfr的基因定位，用PCR walking技術(shù)分析cfr基因的周圍基因序列。同時(shí)對(duì)第一部分篩選出的9個(gè)位于細(xì)菌23S rRNA等位基因domainⅤ區(qū)的點(diǎn)突變，應(yīng)用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Mfold和RNA三級(jí)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件3dRNA分別構(gòu)建23S rRNA domainⅤ區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，以Pymol軟件對(duì)這些空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行突變堿基與藥物空間作用的改變分析。Southern雜交證實(shí)在14株菌株中

9、cfr基因位于質(zhì)粒。對(duì)攜帶cfr基因的約5.6kb質(zhì)粒片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示cfr基因上游是一個(gè)IS256插入序列，下游緊鄰的是一個(gè)orf1基因然后是一個(gè)IS256插入序列。經(jīng)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)本研究的質(zhì)粒片段與1株來(lái)自中國(guó)動(dòng)物源科氏葡萄球菌中攜帶cfr基因的質(zhì)粒pSS-01在序列上有99％同源性。另外，2個(gè)分離自人源的科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的質(zhì)粒pRM01和p7LC，也與本研究中攜帶cfr基因的質(zhì)粒片段在序列上有高度相似性。14株

10、cfr陽(yáng)性菌株中有5株為ST188型，3株為ST965型，而近年來(lái)這些型別主要見于中國(guó)不同地區(qū)分離的動(dòng)物源金黃色葡萄球菌。這些結(jié)果提示這14株金黃色葡萄球菌或者其攜帶的cfr基因可能來(lái)源于動(dòng)物。對(duì)位于23S rRNA domainⅤ區(qū)的9個(gè)突變點(diǎn)，分別構(gòu)建其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，對(duì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):(1) MIC為1μg/ml組中菌株沒有發(fā)現(xiàn)cfr基因或L蛋白突變，僅有的T2238C和G2398A突變點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)上距離利奈唑胺結(jié)合位點(diǎn)距離

11、為94.91(A)和102.8(A)，可能是導(dǎo)致菌株對(duì)利奈唑胺MIC值輕微增高的原因。(2)MIC為2μg/ml組的位于23S rRNA domainⅤ區(qū)的5個(gè)突變點(diǎn)中，突變點(diǎn)C2112T和C2129T在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的堿基配對(duì)均由非常穩(wěn)定的G∶C配對(duì)變?yōu)椴环€(wěn)定的G∶U配對(duì)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能使得rRNA莖區(qū)結(jié)構(gòu)變松散或進(jìn)一步影響三級(jí)空間結(jié)構(gòu);突變點(diǎn)G2127A發(fā)生后，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的堿基配對(duì)由不穩(wěn)定的G∶U配對(duì)變?yōu)橄鄬?duì)穩(wěn)定的A∶U配對(duì)，也

12、會(huì)使得二級(jí)結(jié)構(gòu)的rRNA莖區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生變化。并且本組的5個(gè)突變點(diǎn)C2112T，G2127A，C2129T，C2219T，C2263T在空間結(jié)構(gòu)上距離利奈唑胺結(jié)合位點(diǎn)距離分別為56.06(A)，51.96(A)，54.07(A)，58.83(A)，52.02(A)，距離相對(duì)較近，故這5個(gè)突變點(diǎn)在這些菌株中對(duì)利奈唑胺MIC增高具有較大貢獻(xiàn)價(jià)值。且這組菌株在L3或L22蛋白的氨基酸突變?cè)诳臻g上均位于核糖體肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心（peptidy

13、l transferase center，PTC）區(qū)外，對(duì)利奈唑胺MIC值影響較小。(3) MIC為4μg/ml組細(xì)菌的突變點(diǎn)C2234T和G2416A在三級(jí)空間結(jié)構(gòu)距離利奈唑胺結(jié)合位點(diǎn)距離分別為92.16(A)和72.68(A)，距離較遠(yuǎn)。本組的11株菌株中有8株攜帶有cfr基因，而本組中的L3或L4蛋白氨基酸突變位于PTC區(qū)外，因此cfr基因可能是本組菌株對(duì)利奈唑胺MIC值升高的主因。
　　本研究表明：⑴臨床分離菌株中，沒有檢

14、出符合CLSI耐藥折點(diǎn)的菌株，但細(xì)菌MIC值分布范圍廣，最高M(jìn)IC值菌株和最低MIC值相差16倍，需要嚴(yán)密觀察敏感性降低的發(fā)展趨勢(shì)，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。⑵隨著利奈唑胺MIC值的增高，細(xì)菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點(diǎn)數(shù)量和類型均增多，這種逐漸遞增的突變點(diǎn)數(shù)量和突變類型可能為菌株由對(duì)利奈唑胺敏感變?yōu)槟退幪峁l件。⑶23S rRNA domainⅤ區(qū)突變是MIC為2μg/ml組中菌株對(duì)利奈唑胺MIC增高的主因;而MIC為4μg/ml組