糞腸球菌和屎腸球菌毒力基因、PAI相關基因及耐藥性分析.pdf

1、研究背景： 腸球菌屬(Enterococcus)細菌廣泛分布于土壤、水和食物中，既往認為腸球菌是對人類無害的共棲菌，現(xiàn)已證實腸球菌可引起多種危及生命的感染。近年來，由腸球菌引起的醫(yī)院感染逐年增加，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。臨床感染以糞腸球菌占優(yōu)勢，約占85％～95％；其次為屎腸球菌，約占5％～10％，屎腸球菌引起的感染有增加趨勢；其余少數(shù)為堅韌腸球菌和其它腸球菌，僅占5％以下。腸球菌對現(xiàn)有的大多數(shù)抗菌藥物天然耐藥(如青霉

2、素類、頭孢類抗菌藥物)，使其不易從感染部位清除；此外，腸球菌還可通過基因突變、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)座子等方式獲得耐藥性。致病力的增強是近年來腸球菌發(fā)病率上升的另外一個原因。有研究認為腸球菌也可通過水平轉(zhuǎn)移等方式獲得外源性的毒力基因，使其毒力增強，致病能力提高，這種致病基因還可進一步在種屬之間進行傳播。致病島(pathogenicityisland，PAI)編碼多種毒力因子，一般只存在于致病株中，而不存在于非致病菌。致病島的發(fā)現(xiàn)，極大地改變了人們

3、對細菌毒力進化的認識。2002年，Shankar等在臨床致病糞腸球菌中鑒定出第一個腸球菌致病島，該島大約150kb大小，攜帶致病所需基因，以及一些可能與致病有關、不存在于非感染菌株的潛在毒力基因。目前，國外對腸球菌致病性的研究較多，而國內(nèi)則較少。由于細菌的進化與所處環(huán)境有著非常密切的關系，所以不同地區(qū)的菌株會有著自身的特點，只有掌握本土菌株的致病性、耐藥性以及其種群特點等方面的信息，才能有效地控制腸球菌的感染、傳播以及毒力和耐藥基因的擴

4、散。 研究目的： 了解廣州地區(qū)糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥特征、可能攜帶的毒力基因和致病島相關基因及其頻率；比較臨床菌株和健康人腸道攜帶的糞腸球菌和屎腸球菌在上述方面的差異；通過10株糞腸球菌的多位點序列分型(multilocussequencetyping，MLST)分析結果，初步了解廣州分離菌株的遺傳背景，為進一步開展糞腸球菌的種群研究奠定基礎。 研究方法： 1.菌株本研究的腸球菌共155株(糞腸球菌10

5、3株，屎腸球菌52株)。155株菌株中，醫(yī)院來源的菌株為100株(糞腸球菌55株，屎腸球菌45株)，來自于廣州三家醫(yī)院；健康人腸球菌55株(糞腸球菌48株，屎腸球菌7株)。 2.方法 (1)采用細菌學方法分離、鑒定廣州地區(qū)醫(yī)院及健康人所攜帶的腸球菌； (2)按照NCCLS推薦的K-B法檢測糞腸球菌和屎腸球菌對紅霉素(ERY)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、四環(huán)素(TCY)、高單位慶大霉素(GEH)、萬古霉

6、素(VAN)、替考拉寧(TEC)的敏感性； (3)采用PCR方法檢測所收集菌株的常見毒力基因efaA、gelE、esp、cylA、ace和agg，了解各基因的頻率及分布特征； (4)采用PCR和斑點雜交方法檢測糞腸球菌PAI相關基因nuc，cylB、esp，hyd、psaA和gls24-like，比較不同類型和不同來源菌株所攜帶的PAI相關基因情況； (5)采用多位點序列分型法(MLST)測定10株糞腸球菌7種看

7、家基因gdh，gyd、pstS、gki，xpt、aroE、yqiL的基因序列，將其結果按MLST方法進行分類，與相應數(shù)據(jù)庫進行比較，獲得廣州地區(qū)菌株的序列型(ST)，并與國際相應資料進行比較。 結果： 1.腸球菌的耐藥性檢測藥敏試驗表明，兩種腸球菌對7菌抗菌藥物具有不同的耐藥譜。屎腸球菌中有88.37％對青霉素素產(chǎn)生耐藥性，糞腸球菌中該比例只有2.63％。屎腸球菌對高單位慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素和氯霉素的耐藥率依次為69

8、.77％，93.02％，37.21％，9.30％，糞腸球菌的耐藥率則分別為36.84％，71.05％，77.63％和40.79％。對萬古霉素和替考拉寧的耐藥率則非常低，僅有4株(9.30％)耐萬古霉素屎腸球菌(VRE)，其中2株(4.65％)同時耐替考拉寧；在臨床來源和健康人來源的糞腸球菌中未發(fā)現(xiàn)耐藥性之間的差異。腸球菌的多重耐藥情況較為嚴重，超過一半的菌株對3種及以上抗菌藥物耐藥，屎腸球菌多藥耐藥率高于糞腸球菌。同時耐受紅霉素、四環(huán)素

9、和氯霉素是糞腸球菌中最常見的耐藥譜型，屎腸球菌中則大多同時耐受紅霉素、氨芐西林和高單位慶大霉素。 2.糞腸球菌和屎腸球菌常見毒力因子的檢測毒力基因檢測結果顯示，6個基因廣泛分布于腸球菌中，各基因陽性率由高到低依次為esp(49.68％)、agg(45.16％)、cylA(37.42％)、ace(32.26％)、gelE(27.74％)和efaA(27.74％)。155株腸球菌分離株中有113株至少攜帶一種毒力基因，所占比例為72

10、.90％。糞腸球菌和屎腸球菌攜帶的毒力基因數(shù)目和種類不同，前者上述基因的陽性率分別為48.54％、61.17％、49.51％、46.60％、39.81％、37.86％，后者則為51.92％、13.46％、13.46％、3.85％、3.85％、7.69％；除esp基因外，其它5個基因的陽性率在兩種菌中的差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；此外，攜帶2種以上毒力基因的糞腸球菌占65.05％，屎腸球菌比例僅為17.31％。對不同來源糞腸球

11、菌進行比較，發(fā)現(xiàn)臨床分離株的毒力基因陽性率高于健康人分離株，除了cylA和efaA基因，其余4個基因的陽性率均具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)；兩種來源糞腸球菌攜帶的毒力基因數(shù)目也不同，85.45％的臨床分離株同時含2種以上毒力基因，其中4或5個基因最為常見；健康人分離株中只有41.67％攜帶2種以上毒力基因。 3.糞腸球菌PAI基因在糞腸球菌和屎腸球菌中的分布特征選擇了糞腸球菌致病島上6個功能上不相關、結構上散在分布的基因作為

12、研究致病島的標志，檢測結果顯示各基因陽性率由高至低依次為hyd(81.94％)，psaA(78.06％)、esp(53.55％)、cylB(52.90％)、nuc(45.81％)和gls24-like(38.06％)；esp基因在兩種腸球菌中檢出率相同，其它5個基因則是糞腸球菌高于屎腸球菌，其中nuc、cylB，gls24-like具有統(tǒng)計學差異。在糞腸球菌中，6種基因的陽性率均是臨床分離株高于健康人分離株，結果如下：nuc(83.64

13、％vs39.56％)：cylB(87.27％vs45.83％)；esp(61.82％vs39.58％)；hyd(94.55％vs75.0％)；psaS(92.73％vs70.83％)；gls24-like(74.55％vs25.0％)，差異均具有統(tǒng)計學意義。完整結構的致病島大多出現(xiàn)在臨床分離的糞腸球菌中，占該部分菌株的52.83％(28/53)，在屎腸球菌和健康人糞腸球菌分離株中的比例分別為4.79％(2/42)和28.05％(11/3

14、9)。 4.10株糞腸球菌的多位點序列分型研究在各種細菌分型方法中，MLST技術具有客觀、準確的特點，是目前最為常用的方法之一。采用該方法分析了10株不同來源糞腸球菌的遺傳背景。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這10株菌可被分成6個序列型(sequencetyping，ST)，有4株菌同屬于ST16，2株同屬于ST4，3株菌分別為ST59，ST67，ST116，1株不能與庫中數(shù)據(jù)匹配，可能為新的ST。 結論： 1.糞腸球菌和

15、屎腸球菌對7種常用抗菌藥物具有不同程度的耐藥，許多菌株耐受多種抗菌藥物，糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥譜不同，后者耐藥率和多重耐藥率均高于前者，此結果與其它類似研究的結果相同。提示在臨床治療時進行菌種鑒定、有針對性地使用抗菌藥物是非常必要的，萬古霉素和替考拉寧是治療該類感染的首選藥。值得注意的是此次研究中也檢出了耐萬古霉素和替考拉寧的菌株，提醒我們要加強此類菌株的監(jiān)測，以便盡可能早地發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，防止其傳播和擴散。 2.糞腸球菌和屎腸

16、球菌攜帶的毒力基因存在較大差異，前者的毒力基因陽性率明顯高于后者，并且表現(xiàn)為多基因攜帶，含2種及以上基因的菌株很普遍。說明兩種腸球菌在環(huán)境適應性和致病能力方面存在較大差異，可能具有不同的致病機制；屎腸球菌引起的感染近年呈上升趨勢，毒力基因的獲得是否使其致病性發(fā)生某種變化尚需進一步研究。 3.大小不同、結構不一的致病島元件分布于93.55％的腸球菌中，說明PAI的可塑性非常強，至于其基因丟失的頻率和可能的丟失機制，以及是否存在特定

17、的丟失區(qū)域目前尚不清楚，需進一步研究。從結構上來說，臨床分離糞腸球菌致病島結構相對完整，健康人糞腸球菌和屎腸球菌則缺失較多，提示致病島基因可能參與了糞腸球菌的致病過程。 4.不同來源(健康人分離株、臨床分離株)糞腸球菌對7種抗菌藥物的耐藥性未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但是二者所攜帶的毒力基因和PAI相關基因具有較大差異，一方面可能受到樣本量的影響，另一方面也提示影響糞腸球菌臨床感染率的主要因素可能是毒力大小。 5.10株糞腸球菌的M