屎腸球菌毒力基因hyl的鑒定和功能研究.pdf

1、研究背景：腸球菌是人和動物腸道內(nèi)的G<'+>正常菌群。屎腸球菌毒力較弱，過去十多年內(nèi)，屎腸球菌所引起的感染有所上升，由原來的不到10％，上升到30％～40％。而且臨床上耐萬古霉素腸球菌也絕大多數(shù)是屎腸球菌，在美國ICU達(dá)到了25％。由此可見，屎腸球菌感染的發(fā)病率上升可能與獲得了新的毒力因子有關(guān)。然而屎腸球菌的致病機(jī)制和毒力因子研究甚少，加上多重天然耐藥的存在，臨床治療非常困難。如何防治屎腸球菌的感染是近年來感染學(xué)界研究的熱點(diǎn)?？诜庖咧?/p>

2、療，可能是目前除藥物治療外的一種廉價(jià)、安全、實(shí)用性好、適合大規(guī)模高危人群免疫接種、發(fā)展前景非常好的新型治療方法。 透明質(zhì)酸酶是致病性釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等G+球菌的毒力因子之一。腸球菌原來屬于D組鏈球菌，后來才獨(dú)立分為一屬，但其許多特性與鏈球菌相似。Rice等通過對屎腸球菌基因組進(jìn)行類比分析，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌染色體基因序列中有一開放讀碼框，全長1662bp,其DNA序列以及編碼的氨基酸序列與釀膿鏈球菌透明質(zhì)酸酶有高

3、度同源性。并將這個基因命名為屎腸球菌透明質(zhì)酸酶基因(Hyaluronidase，hyIEfm)。為了研究hyl基因在屎腸球菌致病中的確切功能，我們通過構(gòu)建屎腸球菌hyl基因突變菌株，研究hyl基因在屎腸球菌感染中的作用，并在此基礎(chǔ)上對hyI基因進(jìn)行克隆表達(dá)和純化，探討Hyl蛋白經(jīng)口服免疫小鼠的免疫保護(hù)作用，為屎腸球菌的防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。 目的：構(gòu)建屎腸球菌hyl基因突變株，通過體外生長曲線和體內(nèi)動物模型實(shí)驗(yàn)來研究hyl基因敲除前

4、后屎腸球菌的毒力變化。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建hyl基因重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，探討Hyl蛋白經(jīng)口服免疫小鼠后，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和體內(nèi)抗菌保護(hù)作用。 方法：用攜帶hyl基因插入序列的自殺質(zhì)粒pTX4577通過體內(nèi)同源重組，使hyl基因斷裂而構(gòu)建hyl基因突變株。突變株用PCR、脈沖場電泳和Southern blot進(jìn)行鑒定。通過與野生株TX2466相比，觀察突變株體外的生長能力以及小鼠腹膜炎模型和兔心內(nèi)膜炎模型

5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的毒力改變情況。然后用PCR擴(kuò)增hyl基因片段，克隆至pQE-30質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE-hyl，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Hyl；Western blot分析其免疫反應(yīng)性。融合蛋白經(jīng)鎳離子柱純化后，用Hyl蛋白和屎腸球菌全菌蛋白TX2466分別給小鼠灌胃進(jìn)行免疫，ELISA檢測小鼠血清IgG和IgA、小腸粘液sIgA和糞便sIgA水平。然后用TX2466腹腔攻擊已免疫的小鼠，觀察其體內(nèi)抗菌保護(hù)性

6、。 結(jié)果：經(jīng)同源重組，利用卡那霉素抗性篩選，PCR、脈沖場電泳和Southern blot進(jìn)行鑒定獲得基因突變株hyl mutant。突變株在體外的生長能力低于野生株。突變株在小鼠腹膜炎模型中的半數(shù)致死量(LD<,50>)提高了7倍，在相同細(xì)菌感染濃度(3.7×109 cfu)下，hyl mutant組小鼠的存活率為50％，而野生株TX2466組小鼠的存活率為0，差異有顯著性。6h和12 h外周血白細(xì)胞變化低于野生株，6 h腹水

7、中的TNF-α水平和腹膜活化的TNF-α蛋白低于野生株組。兔心內(nèi)膜炎模型中，hyl mutant組則分別為(2.11±0.59)×10<'5> cfu/g和(6.59±0.53)×10<'5>cfu/g，而TX2466組主動脈瓣和壁性贅生物的菌落計(jì)數(shù)分別為(3.04±0.63)×10<'6> cfu/g和(6.87±0.58)×10<'6>cfu/g,差異同樣有顯著性。PCR擴(kuò)增后，測序hyl基因全長1662 bp，為編碼553個氨基酸

8、殘基的多肽。SDS-PAGE分析相對分子量約為60 000。表達(dá)量占全菌的38％以上，經(jīng)親和層析后可獲得純度為90％以上的重組蛋白。Western blot證實(shí)了其免疫反應(yīng)性。灌胃免疫小鼠后，ELISA檢測結(jié)果Hyl蛋白組血清IgA、IgG，糞sIgA，腸黏液slgA．分別為0.365±0.048，0.431±0.064，0.743±0.056和1.112±0.113，對照組則分別為0.051±0.013，0.098±0.019，0.1

9、02±0.032和0.187±0.051，差異有顯著性。通過細(xì)菌攻擊后，小鼠的平均存活時間也明顯長于對照組。 結(jié)論：hyl基因突變株hyl mutant構(gòu)建成功，hyl基因在屎腸球菌致病中起著重要的作用，可能是屎腸球菌的毒力因子之一。hyl基因表達(dá)載體pQE-hyl構(gòu)建成功，表達(dá)的融合蛋白Hyl經(jīng)口服免疫可有效誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平的sIgA，發(fā)揮局部粘膜免疫作用和抗菌保護(hù)作用。Hyl有可能作為預(yù)防屎腸球菌口服疫苗的候選抗