氟喹諾酮類藥物對糞腸球菌防耐藥突變濃度及分子耐藥機制研究.pdf

1、目的：
　　1.在糞腸球菌中建立體外防細菌耐藥突變濃度（Mutant PreventionConcentration，MPC）的測定方法，通過測定4種氟喹諾酮類藥物(FQs)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星對糞腸球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變體及臨床分離糞腸球菌的最低抑菌濃度(MIC)、防耐藥突變濃度(MPC)和耐藥突變選擇窗(Mutant Selection Window，MSW)，比較不同的氟喹

2、諾酮類藥物的抗菌能力，并結(jié)合已有的藥代動力學(xué)參數(shù)，比較4種藥物的防細菌耐藥突變的能力。
　　2.探討不同化學(xué)結(jié)構(gòu)、不同濃度的FQ藥物對耐藥突變株恢復(fù)生長的影響和在耐藥突變選擇窗(MSW)內(nèi)篩選的細菌耐藥突變體的分子耐藥機制。
　　3.結(jié)合MPC、MSW理論、藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)(PK/PD)理論對臨床優(yōu)化氟喹諾酮類藥物的給藥方案提供初步依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用肉湯富集細菌法富集1010cfu/ml糞腸球

3、菌，采用標準的瓊脂二倍稀釋法測定4種氟喹諾酮類藥物對糞腸球菌標準菌株ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變株的最低抑菌濃度(MIC)、MIC99、暫定MPC(MPCpr)及防耐藥突變濃度(MPC)，同時進行菌落計數(shù)法測定和描記細菌恢復(fù)生長曲線，計算比較ATCC29212及其同源耐藥突變體的耐藥突變選擇窗(MSW)和選擇指數(shù)SI(MPC/MIC)。
　　2.在相應(yīng)藥物的耐藥突變選擇窗內(nèi)篩選細菌耐藥突變株，應(yīng)用PCR技術(shù)對

4、gyrA和parC的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)進行擴增，測序后進行在線Blast比對，確定其靶位突變位點，并采用外排泵表型抑制試驗測定利血平對環(huán)丙沙星和加替沙星MIC的影響。
　　3.瓊脂二倍稀釋法測定4種FQs藥物對40株環(huán)丙沙星敏感的和15株環(huán)丙沙星耐藥的糞腸球菌臨床分離株的MIC及MPCpr，計算MIC90、MPCpr90及選擇指數(shù)SI(MPCpr90/MIC90)，比較4種氟喹諾酮類藥物在臨床治療劑量條件下的防耐藥突變能

5、力。
　　結(jié)果：
　　1.4種氟喹諾類藥物對糞腸球菌ATCC29212的MIC99由低到高為:莫西沙星＜加替沙星＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星，MIC99的結(jié)果提示，莫西沙星的抗菌活性最強;加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對糞腸球菌ATCC29212的MPC分別為1.2、1.2、5.6和6.4μg/ml，選擇指數(shù)(即MPC/MIC99)分別為3.4、6、8和8，以加替沙星的選擇指數(shù)最小。糞腸球菌ATCC29212的細菌恢復(fù)生

6、長曲線顯示，莫西沙星和加替沙星的平臺期小于環(huán)丙沙星和左氧氟沙星。
　　2.4種FQs藥物對糞腸球菌ATCC29212同源第一步突變體的MIC較源菌株ATCC29212升高2～4倍，其他氟喹諾酮類藥物對其MIC值也有2～4倍的升高，對加替沙星篩選第二步突變體的MIC較第一步突變體又升高2～4倍。糞腸球菌ATCC29212經(jīng)4種FQs篩選出的第一步耐藥突變體對環(huán)丙沙星已達到耐藥，對左氧氟沙星也達到了中介耐藥(MIC=4μg/ml)，而

7、對莫西沙星和加替沙星仍然敏感（MIC:0.5～2μg/ml），但第二步突變體對莫西沙星和加替沙星也已達到了中介耐藥(MIC=4μg/ml);4種FQs藥物對第一步耐藥突變體的MPC值均較ATCC29212源菌株升高2～4倍;加替沙星和莫西沙星對第一步突變體的MPC值均低于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，對第二步耐藥突變體的MPC已高達32μg/ml;加替沙星、莫西沙星和左氧氟沙星對第一步耐藥突變體的MSW較源菌株增寬。
　　3.根據(jù)4種FQ

8、s對糞腸球菌ATCC29212的MSW測定結(jié)果以及加替沙星篩選第二步耐藥突變株，共隨機篩選了32株同源耐藥突變株，對該32株同源耐藥突變株的gyrA和parC的QRDR進行耐藥突變位點分析，發(fā)現(xiàn)一步耐藥突變株中均沒有出現(xiàn)堿基位點的突變，而只有加替沙星篩選的第二步耐藥突變株出現(xiàn)了parC的QRDR位點突變，主要是第80位氨基酸密碼子的改變Ser80→Ile(AGC→ATC);利血平抑制實驗提示主動外排機制介導(dǎo)了非靶位改變的耐藥突變株的耐藥

9、性。
　　4.加替沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對40株環(huán)丙沙星敏感的糞腸球菌臨床分離株的MPCpr90分別為2、1、4和4μg/ml，選擇指數(shù)(SI)分別為4、4、8和8;加替沙星和莫西沙星對15株環(huán)丙沙星中介耐藥的糞腸球菌臨床分離株的MPCpr90分別為32和16μg/ml，選擇指數(shù)均達到了32。
　　結(jié)論：
　　對于糞腸球菌ATCC29212、ATCC29212同源耐藥突變株及糞腸球菌臨床分離株，加替沙星和

10、莫西沙星的抗菌活性均高于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，且加替沙星和莫西沙星限制糞腸球菌耐藥突變體被選擇出來的能力強于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，參照藥動學(xué)參數(shù)，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星很容易篩選出下一步耐藥突變株，而加替沙星和莫西沙星則能限制下一步耐藥突變株的產(chǎn)生。但對于第二步耐藥突變株，加替沙星和莫西沙星的MPC增高，MSW增寬，也很容易篩選出對這兩種藥物也耐藥的菌株。由此可以看出，臨床上為延長加替沙星和莫西沙星的使用壽命，對于環(huán)丙沙星已經(jīng)達到了耐藥的

11、菌株應(yīng)避免再用加替沙星和莫西沙星的單藥治療方案。另外，從本次研究也可以看出，糞腸球菌對FQs類藥物的耐藥性是逐步產(chǎn)生和發(fā)展的，一旦發(fā)生第一步的耐藥性突變，其MPC值逐漸增高，MSW逐漸增寬，導(dǎo)致第二步耐藥突變體更加容易被選擇出來，只有將第一步耐藥性突變阻斷后，才有可能抑制細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥進展，而對氟喹諾酮類藥物敏感性下降的糞腸球菌同源耐藥突變株，主要是編碼拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的ParC亞單位基因（parC）發(fā)生了單個點突變(AGC→A