環(huán)境喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)方法及其應(yīng)用.pdf

1、抗生素從發(fā)現(xiàn)開(kāi)始，已經(jīng)被廣泛使用于臨床、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧業(yè)等。在抗生素被廣泛使用的同時(shí)，大量的抗生素被持續(xù)不斷地排放至環(huán)境當(dāng)中，從而造成一系列的環(huán)境問(wèn)題。微生物的耐藥性作為最為重要的問(wèn)題之一已經(jīng)成為環(huán)境工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。 本研究以北京溫榆河流域水樣為研究對(duì)象，調(diào)查了環(huán)境中E．coli(大腸桿菌)對(duì)喹諾酮的耐藥情況。其中的工作包括革蘭氏陰性菌總DNA的耐藥基因分析，耐喹諾酮E．coli的發(fā)生率的調(diào)查，E．coli耐喹諾酮能力的檢測(cè)，

2、耐藥突變位點(diǎn)分析及E．coli的致病因子檢測(cè)。 在本研究中沿溫榆河流域設(shè)計(jì)了12個(gè)采樣點(diǎn)，通過(guò)PCR與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合的方法，檢測(cè)了過(guò)夜培養(yǎng)后的濾膜上，革蘭氏陰性菌總DNA中對(duì)三種抗生素的耐藥基因，即抗磺胺類(sulI、sulII、sulIII)、四環(huán)素類(tetA、tetB、tetM)、β—內(nèi)酰胺酶類(TEM)基因。結(jié)果表明，磺胺類、四環(huán)素類、β—內(nèi)酰胺類類抗生素的耐藥基因在溫榆河流域被廣泛檢出。其中tetM在所有采樣點(diǎn)都呈

3、陰性，而1號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、19號(hào)采樣點(diǎn)的耐藥基因有部分耐藥基因未檢出，包括tetA或sulIII；但其他采樣點(diǎn)5、12、18，20、25、26號(hào)，除tetM外全都呈陽(yáng)性；昆明湖樣品位于生活區(qū)上游，屬于污染較少的區(qū)域，耐藥菌檢出率明顯低于其他地區(qū)，但除了tetM、sutIII，其他耐藥菌也有檢測(cè)出來(lái)。從各個(gè)采樣點(diǎn)耐藥基因的檢出狀況來(lái)看，這幾種抗生素的耐藥基因在溫榆河水體中具有一定的發(fā)生率和普遍性，其種類并不沿水體流向而增加或減少，可能受多

4、種環(huán)境條件的影響。 同時(shí)，本研究還以總DNA為模板擴(kuò)增出gyrA基因中喹諾酮耐藥決定區(qū)域(QRDR)，其DNA序列的測(cè)序結(jié)果用Bioedit軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列只有幾個(gè)無(wú)意突變位點(diǎn)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道相應(yīng)的耐藥突變。 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI，前稱為NCCLS)，大腸桿菌抗左氧氟沙星和加替沙星MIC達(dá)到8 ug/mL為耐藥，因而我們采用了不含抗生素的平板和含8 ug/mL的喹諾酮平板來(lái)培養(yǎng)濾膜上的E

5、．coli，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得知，沿溫榆河流域耐LEV的E．coli發(fā)生率在2.3％～31.3％之間，對(duì)GAT耐藥的發(fā)生率在0.8％～57.8％之間。為了進(jìn)一步確認(rèn)環(huán)境中喹諾酮耐藥性的發(fā)生，我們從各采樣點(diǎn)，不同喹諾酮梯度的濾膜上隨機(jī)篩選了共161株E．coli。 E．coli對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥性分析包括耐藥能力檢測(cè)及突變位點(diǎn)分析兩個(gè)方面。首先，鑒定E．coli耐藥能力，即最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。本文采用瓊脂稀釋法測(cè)定了

6、每株菌對(duì)兩種喹諾酮的MIC，結(jié)果表明，E．coli對(duì)第三代喹諾酮LEV的MIC顯著高于對(duì)第四代喹諾酮GAT的MIC，有兩株E．coli對(duì)LEV的MIC甚至高達(dá)128 ug/mL，而E．coli對(duì)GAT也已經(jīng)有一定的耐藥性，MIC最高為32 ug/mL。其次，是對(duì)不同耐藥水平的E．coli的QRDR突變位點(diǎn)的分析，針對(duì)喹諾酮作用的機(jī)理，以gyrA基因和parC基因?yàn)槟繕?biāo)，尋找不同突變位點(diǎn)對(duì)E．coli的耐藥能力的貢獻(xiàn)。突變位點(diǎn)的分析結(jié)果表

7、明，gyrA基因中S83L突變的發(fā)生具有普遍性，并且有很多發(fā)生在MIC非常低的菌株中，而D87N突變則主要發(fā)生在LEV耐藥菌株中，推測(cè)是E．coli耐藥的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)；D87Y主要發(fā)生在對(duì)LEV的MIC在128 ug/mL和64 ug/mL中，表明該位點(diǎn)可能是E．coli具有很高的耐藥能力的關(guān)鍵因子。 耐藥E．coli中的耐藥基因及菌株作為一種環(huán)境污染，對(duì)各種人類及動(dòng)物的健康都存在威脅，而E．coli的致病性更加劇了這種污染的危