糞腸球菌生物學特性研究.pdf

1、糞腸球菌是口腔中常見的致病菌，是導致人類疾病的腸球菌中最常見的一種病原菌，尤其是在根管再感染的樣本中，糞腸球菌是檢出率最高的細菌。糞腸球菌通過形成生物膜的形式引起感染。同時，糞腸球菌的致病能力與其表面蛋白的種類和功能密切相關。細菌表面蛋白是理解其與宿主相關行為的關鍵分子。這些蛋白參與細胞壁形成與維持，與宿主的相互反應，以及毒力因子。分析糞腸球菌能夠逃逸根管治療過程中多種抑菌手段的機制，對于預防并治療根管治療失敗所致的再次感染，具有很好的

2、臨床意義。
　　本研究分為三個部分：
　　第一部分擬在實驗室條件下，摸索不同條件的誘導方法成功的在體外誘導糞腸球菌進入“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)，并分析在此狀態(tài)下糞腸球菌的生理，生化特性，以及與其致病能力相關的特性，如形態(tài)學，代謝特點，產酸耐酸能力，粘附能力，基因表達變化情況等進行相關研究。
　　結果顯示：糞腸球菌在多種惡劣的條件下均能夠進入到“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)，并通過發(fā)生形態(tài)改變，減少代謝反應和基因表達等生理性活動，抵抗

3、環(huán)境變化帶來的損害。同時，在此狀態(tài)下的糞腸球菌仍具有一定的產酸，粘附等致病能力并表達一部分致病相關的基因。在適宜條件下，“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)下的糞腸球菌能夠恢復細胞增長分裂，以及致病能力，對宿主健康產生威脅。
　　第二部分使用質譜非標記定量蛋白質組學技術，對浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)的糞腸球菌的表面蛋白表達的差異進行研究。分析兩種狀態(tài)糞腸球菌表面蛋白表達量差別及其代表的相關功能差異，進一步探索糞腸球菌以生物膜形式致病的機制。結果顯示：與

4、浮游狀態(tài)的糞腸球菌相比，生物膜狀態(tài)的糞腸球菌其表面蛋白表達具有明顯差異的蛋白有303種，其中108種差異倍數(shù)在2倍以上（73種蛋白表達上調，35種表達下調）。分析全部的108種識別蛋白可知，其中有71種差異蛋白鑒定為胞漿蛋白，多為核糖體蛋白類或延長因子，而另外37種差異蛋白則鑒定為細菌表面相關蛋白。大部分的表面相關蛋白在糞腸球菌生物膜組表現(xiàn)為表達上調。糞腸球菌表達差異的37種表面相關蛋白中，有5種蛋白以LPxTG的方式錨定于細胞壁；17

5、種蛋白具有脂類錨定，推測為胞外蛋白，其功能多以細胞胞外溶質結合蛋白SBPs的形式；其余15種蛋白為膜蛋白，其中6種蛋白具有N-端錨定，9種蛋白具有多跨膜區(qū)段TMHs。
　　第三部分使用深度測序技術為基礎的轉錄組測序，對生物膜狀態(tài)糞腸球菌全基因組范圍進行轉錄測序并繪制通路圖譜。結果顯示：測序獲得生物膜狀態(tài)糞腸球菌可匹配Reads數(shù)為26911175，經拼接獲得2552個轉錄本；其中有1657個轉錄本可共同對比到4個參考基因組；共19

6、13個轉錄本注釋到參考基因，其余639個采用序列相似對比后有387個轉錄本可以對比上NR數(shù)據(jù)庫中的蛋白；1763個轉錄本分類到不同的COG功能中，多集中于信息儲存與處理，代謝，以及細胞進程和信號肽等；KEGG分析得到170條通路，排除真核生物后得到74條KEGG pathway，顯著富集于能量及物質代謝，復制和修復，轉錄，信號轉導，以及聚糖合成與代謝等細胞進程。
　　本課題研究結果從一定程度上證明了糞腸球菌進入“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)

7、是其抵抗惡劣環(huán)境的一個可能機制；糞腸球菌的表面蛋白多與細胞壁合成及維持，細菌粘附作用，毒力因子以及信號轉導功能相關，這些表面蛋白也可能參與一些細菌活動，例如溶質的轉運，以及生物素調控過程等；生物膜狀態(tài)下的糞腸球菌，能量及物質代謝活躍，細胞增值速度加快，信號轉導以及信息通路等細胞進程均參與了糞腸球菌的毒力及致病過程。
　　研究結果從理論上進一步補充了根管感染的細菌病因學學說，生物膜狀態(tài)糞腸球菌的蛋白質組學和轉錄組學分析，為深入理解糞