感染豬的腸球菌生物學(xué)特性研究.pdf

1、腸球菌為球形或卵圓形、呈鏈狀排列的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，自從1984年單獨(dú)成屬以來(lái)，已由原來(lái)的兩個(gè)種增加到41個(gè)種。腸球菌不但可引起醫(yī)院內(nèi)病人的腹膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎和腦膜炎等，也可引起豬、羊、雞和鴨等動(dòng)物的感染，感染動(dòng)物的腸球菌也可直接傳染給人，污染食品中的腸球菌也可導(dǎo)致人的食物中毒，因此腸球菌在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要的意義。2003～2007年期間，在河南省許昌、南陽(yáng)、鄭州、洛陽(yáng)等地患有敗血癥、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎的病豬體內(nèi)分離到42株疑似腸球菌

2、，對(duì)其進(jìn)行了常規(guī)的形態(tài)學(xué)觀察、耐受性試驗(yàn)、生化鑒定和全細(xì)胞蛋白型分析，并進(jìn)行了16SrRNA和RAPD等分子水平探討，以期為進(jìn)一步研究感染豬的腸球菌多樣性及豬源腸球菌感染的臨床治療和公共衛(wèi)生學(xué)意義提供參考依據(jù)。 42株分離菌全呈G+，卵圓形或球形，并呈長(zhǎng)短不一的鏈狀排列，能夠在6.5％NaCl肉湯、pH9.6葡萄糖肉湯、10℃、45℃和60℃30min條件下生長(zhǎng)。Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)42株中的34株成功進(jìn)行了鑒定

3、，鑒定率81.0％，其中糞腸球菌（E.faecalis）10株、屎腸球菌（E.faecium）2株、鉛黃腸球菌（E.casseliflavus）22株，另有8株分離菌未鑒定到種的水平；細(xì)菌全細(xì)胞蛋白型分析結(jié)果表明，42株分離菌全細(xì)胞蛋白條帶呈現(xiàn)出兩種完全不同的聚類型，據(jù)此可將42株分離菌分為兩種類型，兩種類型電泳條帶的分子量差異主要在97KDa、90KDa、67KDa和46KDa處，一種類型具有蛋白分子量90KDa的條帶，而另一種類型則

4、具有46KDa、67KDa和97KDa3個(gè)條帶，因此，90KDa條帶和46KDa、67KDa和97KDa3個(gè)條帶可作為這兩種類型腸球菌的特征性區(qū)別條帶。 16SrRNA基因序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法。我們采用細(xì)菌通用16SrRNA引物對(duì)42株感染豬的腸球菌16SrRNA全基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pTG19-T載體中進(jìn)行測(cè)序，所得序列用BLAST軟件與GenBank中相關(guān)屬種的16SrRNA序列比較，結(jié)果表明

5、42株腸球菌的16SrRNA序列與GenBank中登錄的各種腸球菌同源性較高。利用DNAStar軟件將42株感染豬的腸球菌與GenBank中32種腸球菌的16SrRNA序列進(jìn)行序列同源性分析，42株分離菌均鑒定到種的水平，其中12株感染豬的腸球菌與GenBank中登錄的4株糞腸球菌（E.faecalis）模式菌株（AF515223、AJ301831、EU728747、NC_004668）的同源性在99.3％～99.9％之間；30株感染豬

6、的腸球菌與GenBank中登錄的3株屎腸球菌（E.faecium）模式菌株（EU547780、DQ411813、Y18294）的同源性在99.3％～100％之間。同時(shí)，我們測(cè)定的42株腸球菌（HN-N1～HN-N42）16SrRNA序列已被GenBank收錄，按菌株順序其登錄序列號(hào)（accessionnumber）分別為為FJ378656～FJ378697。與已公布的腸球菌種特異性探針序列相比較，42株腸球菌16SrRNA基因序列均含有

7、屎腸球菌和糞腸球菌種特異性探針序列。 利用19條隨機(jī)引物以隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)對(duì)42株分離菌進(jìn)行了鑒別。結(jié)果表明，有4條引物對(duì)所有菌株擴(kuò)增均得到多態(tài)性較好的條帶，每株菌DNA擴(kuò)增條帶數(shù)在1～10條之間，不同菌株所得的片段大小介于200～4000bp之間，4條引物擴(kuò)增42個(gè)菌株共觀察到673條清晰的帶紋，每條引物平均產(chǎn)生168.3個(gè)擴(kuò)增片斷，每株腸球菌平均產(chǎn)生4個(gè)擴(kuò)增片斷。SPSS13.0軟件計(jì)算其相似性系數(shù)和遺傳

8、距離指數(shù)，利用最短距離法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，HN-N3和HN-N6兩菌株間遺傳距離指數(shù)為0.000，推測(cè)其可能為同源株。在聚類重新標(biāo)定距離（rescaleddistanceclustercombine）為23的水平上，42株腸球菌可分為兩大聚類群，這與16SrRNA的鑒定結(jié)果完全一致，這說(shuō)明聚類重新標(biāo)定距離23可以進(jìn)行腸球菌種的鑒定；30株屎腸球菌在聚類重新標(biāo)定距離為16的水平上分為9大聚類群；12株糞腸球菌與3株糞腸球菌陽(yáng)性參考