脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片生物學特性研究.pdf

1、小腸粘膜下層（Small intestinal submucosa，SIS）是一種天然的細胞外基質(zhì)，主要成分是膠原蛋白。SIS經(jīng)加工后制成的修復(fù)材料具有良好的生物相容性、適當?shù)慕到庑?、低或無免疫原性、一定的機械強度等特性。目前， SIS修復(fù)材料廣泛用于血管、膀胱、腸道、肌腱以及泌尿系統(tǒng)等組織修復(fù)中。
　　本研究所采用的脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片是由豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細胞、凍干、滅菌等工藝制成，臨床上擬通過長期植入體內(nèi)修復(fù)疝氣、肛

2、瘺等部位軟組織的損傷。本研究針對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片生物學特性中的降解規(guī)律和免疫毒性兩方面進行臨床前研究，為其更安全、有效的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　（1）為了更加可靠地研究脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的免疫毒性，本研究利用細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）優(yōu)化大鼠免疫刺激模型，為其免疫毒性研究設(shè)立免疫刺激組。選取Wistar大鼠42只，隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、免疫抑制組、LPS給藥后6h組、L

3、PS給藥后12h組、LPS給藥后24h組和LPS給藥后48h組。對大鼠進行給藥處理后取材并檢測以下指標：大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學參數(shù)、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖、細胞因子（IL-1β和TNF-α）含量。結(jié)果顯示， LPS給藥后6h、12h組在免疫器官系數(shù)、血液學參數(shù)、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖、細胞因子含量方面均出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與空白對照組、假手術(shù)組比較存在顯著性差異（p<0.05），而12h組的免疫刺激現(xiàn)

4、象更加明顯。LPS給藥后24h、48h組的免疫刺激現(xiàn)象不明顯；免疫抑制組在免疫器官系數(shù)、血液學參數(shù)、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖、細胞因子含量等方面均出現(xiàn)一定的免疫抑制現(xiàn)象，與空白對照組、假手術(shù)組比較存在顯著性差異（p<0.05）。上述結(jié)果說明，大鼠腹腔注射LPS后12h的免疫刺激現(xiàn)象最明顯，可作為大鼠免疫刺激模型用于脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的免疫毒性研究中。
　?。?）本研究對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的免疫毒性進行了

5、探討。選取Wistar大鼠80只，隨機分為高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對照組、免疫抑制組和免疫刺激組，依據(jù)考察周期將每組16只大鼠再隨機分為1、4、8和12周4個實驗操作小組（n=4）。對大鼠進行埋植/給藥處理后取材并檢測以下指標：大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學參數(shù)、免疫器官病理學、NK細胞殺傷活性、T淋巴細胞亞群、淋巴細胞增殖、補體C3蛋白含量、免疫球蛋白（IgG、IgM）含量、細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）含量。結(jié)果

6、顯示，第1、4、8和12周的各時間點，高劑量組、低劑量組與假手術(shù)對照組在大鼠體重變化、血液學參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學分析、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖試驗、免疫球蛋白含量、細胞因子含量的測定方面變化趨勢基本一致，各組數(shù)據(jù)間相比不存在顯著性差異（p>0.05）；高劑量組和低劑量組在NK細胞殺傷活性和補體C3含量測定方面與假手術(shù)對照組有一定差異。免疫刺激組大鼠在血液學參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學檢查、T淋巴細胞亞

7、群分析、淋巴細胞增殖方面出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對照組比較有顯著性差異（p<0.05）；免疫抑制組大鼠在血液學參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學檢查、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖方面出現(xiàn)不同程度的免疫抑制現(xiàn)象，與高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對照組比較有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果說明，大鼠腹部皮下埋植脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片后未見明顯的免疫毒性反應(yīng)。
　　（3）本研究從體外降解和體內(nèi)降

8、解兩方面對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的降解規(guī)律進行研究。體外降解包括加速降解和常規(guī)降解兩方面。其中加速降解是在0.5mg/mL的Ⅰ型膠原酶中震蕩進行，于不同時間點取出樣品碎片，計算其降解率。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，脫細胞豬小腸粘膜疝修補片在0.5mg/mL的Ⅰ型膠原酶中逐漸降解，酶解20h降解率達到68％左右，此前的降解率均低于相同時間點下COOK疝修補片的降解率，此后二者降解率接近，至96h降解率均90%以上。常規(guī)降解是在0.01

9、M PBS中靜置進行，于不同時間點取出樣品碎片，計算其降解率。結(jié)果顯示，脫細胞豬小腸粘膜疝修補片靜置30d時幾乎未發(fā)生降解，此后隨著時間的延長，逐漸降解，至靜置180d時，降解率達到90%以上。體內(nèi)降解的體內(nèi)埋植實驗跟免疫毒性研究的埋植實驗同步進行，分別于大鼠腹部皮下植入脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片后1周、4周、8周和12周對其進行埋植部位大體觀察和組織學觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埋植部位大體觀察，隨著植入周期的延長，第1、4、8周的脫細胞豬小腸

10、粘膜下層疝修補片不斷被結(jié)締組織包裹，并逐漸降解吸收，至植入12周脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片與周圍結(jié)締組織完全融合。組織學觀察，隨著植入周期的延長，第1、4、8周的脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片逐漸與周圍結(jié)締組織融合，炎癥細胞逐漸減少，至植入12周該材料與周圍結(jié)締組織基本融合，局部僅見少量散在炎癥細胞浸潤，未見明顯炎癥病變。大鼠皮下植入脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片12周時，皮下脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片基本完全降解。降解實驗結(jié)果說明，脫