“小腸粘膜下層促嗅鞘細(xì)胞增殖”的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.探討單次差速貼壁法純化培養(yǎng)成年大鼠嗅球嗅鞘細(xì)胞的可行性； 2.探索Abraham法制取豬小腸粘膜下層的可靠性，并進(jìn)一步探討以小腸粘膜下層作為支架對(duì)嗅鞘細(xì)胞是否有促增殖作用。 方法： 1.將成年SD大鼠的嗅球分離消化后成細(xì)胞懸液后接種，然后在接種后的18h行單步驟差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，純化嗅鞘細(xì)胞；純化培養(yǎng)11天左右經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體P75(NGFRP75)和碘化丙啶(PI)雙重免疫熒光鑒定嗅

2、鞘細(xì)胞、分析其純度及計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量；根據(jù)細(xì)胞移植純度和數(shù)量的要求，選出適宜的方法培養(yǎng)下一步用于移植的嗅鞘細(xì)胞； 2.1)生物支架-豬小腸粘膜下層的制備：參照Abraham法將屠宰4個(gè)小時(shí)內(nèi)的新鮮豬小腸通過(guò)物理、化學(xué)方法處理，制得豬小腸粘膜下層，HE染色及掃描電鏡檢測(cè)證實(shí)無(wú)任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在。2)實(shí)驗(yàn)分組：將通過(guò)上述方法獲得的純凈的小腸粘膜下層與純化的嗅鞘細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，單純嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)作為對(duì)照組，定期倒置顯微鏡、HE染色、掃

3、描電鏡觀察細(xì)胞、細(xì)胞與材料的粘附生長(zhǎng)情況以及CCK8增殖實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果： 1.經(jīng)18h單次差速貼壁法純化培養(yǎng)11天左右，共聚焦顯微鏡下FITC-NGFR p75與PI雙染陽(yáng)性的細(xì)胞即為嗅鞘細(xì)胞，其形態(tài)多樣：梭形細(xì)胞、雙極細(xì)胞、三極細(xì)胞以及多級(jí)細(xì)胞、扁平細(xì)胞等；細(xì)胞純度可達(dá)70-80％，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量達(dá)106/ml。 2.1) Abraham法制得的豬小腸粘膜下層經(jīng)HE染色及掃描電鏡鏡檢

4、證實(shí)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在。2)實(shí)驗(yàn)組：小腸粘膜下層與嗅鞘細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)嗅鞘細(xì)胞在24h內(nèi)即可貼壁生長(zhǎng)；培養(yǎng)3-5d后，可見(jiàn)小腸粘膜下層邊緣嗅鞘細(xì)胞密集，粘附良好，形態(tài)以梭形細(xì)胞、三極細(xì)胞為主。不同時(shí)間點(diǎn)HE染色、掃描電鏡觀察可見(jiàn)嗅鞘細(xì)胞與豬小腸粘膜下層附著緊密，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。CCK8細(xì)胞增殖定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，嗅鞘細(xì)胞數(shù)量明顯增加，7-9d后即可達(dá)到平穩(wěn)水平，11d后細(xì)胞水平略有下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組

5、在培養(yǎng)的前5d細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，培養(yǎng)至第7d后無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.18h單次差速貼壁法能成功純化、培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞至11天左右，純度可達(dá)70-80％，數(shù)量級(jí)達(dá)106/ml，基本滿足嗅鞘細(xì)胞移植純度及數(shù)量要求，方法簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好； 2.Abraham法是一種簡(jiǎn)單可靠制取純凈小腸粘膜下層的方法；未發(fā)現(xiàn)小腸粘膜下層對(duì)嗅鞘細(xì)胞有促增殖作用，但兩者間生物相容性