脫細胞羊膜與小腸黏膜下層促進大鼠皮膚缺損修復和血管形成.pdf

1、目的: 皮膚具有重要的物理、化學及生物學屏障功能，皮膚創(chuàng)傷所引起的局部或全身損害均與皮膚屏障的喪失有關，盡早修復缺損皮膚并最大可能恢復功能與外觀已成為治療重要目標。傳統(tǒng)修復方法有：自體植皮、同種異體植皮、異種植皮和人工合成皮膚產(chǎn)品的應用。但由于供區(qū)不足、免疫排斥及傳播疾病等缺點，使其應用受到限制，尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上一個亟待解決的難題。組織工程學技術在天然或生物合成材料上接種皮膚干細胞，在生物支架逐步降解吸收的過

2、程中，種植的細胞繼續(xù)增生繁殖，形成新的組織工程化皮膚，達到修復創(chuàng)傷和重建自身組織功能的目的。因此，“組織工程”的提出為人工構建皮膚替代物提供了嶄新且富有挑戰(zhàn)性的新方法。在皮膚組織工程中，生物支架材料一直是其研究的熱點，其產(chǎn)品血管化成為其發(fā)展的瓶頸問題。而近年來研究表明脫細胞小腸黏膜下層(small intestinal submucosa，SIS)和脫細胞羊膜(acellular human amniotic membrane，HAM)

3、是兩種很好的生物支架材料，它們在其它前期臨床的實驗中表現(xiàn)出了很好的生物相容性，促近傷口愈合，更重要的是對各種損傷組織再生有特異的重塑性。有研究表明這兩種生物支架材料對皮膚的創(chuàng)傷愈合有相似的修復效果，這兩種支架材料區(qū)別在于脫細胞羊膜具有天然的基底膜?；啄ぶ饕散粜湍z原、Ⅶ型膠原和層粘連蛋白組成。層粘連蛋白LN，是由不同的蛋白質分子組成的一個蛋白質家族，是細胞外基質(ECM)中的非膠原糖蛋白。由Timpl等于1979年首次從鼠ESH肉瘤中

4、發(fā)現(xiàn)并命名。它廣泛分布于基底膜的透明層，緊貼細胞基底部，與Ⅳ型膠原結合形成基底膜的骨架，影響細胞的黏附、運動，調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。羊膜基底膜厚而連續(xù)，LN作為羊膜基底膜特異和主要的蛋白組成成分，具有與Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素等分子結合的部位，同時還可與上皮細胞結合，觸發(fā)細胞內(nèi)的信號轉導，促進它們黏附在Ⅳ型膠原上并鋪展開，從而促進細胞移行與增殖。 本研究將脫細胞羊膜、脫細胞小腸黏膜下層覆蓋于SD大鼠創(chuàng)傷性皮膚缺損上，觀察它們對創(chuàng)面

5、愈合的作用，同時在基因表達水平上檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達情況，觀察它們對創(chuàng)傷皮膚血管形成的影響，擬找到一種對皮膚血管化有更好效果的的生物支架材料。 方法: 1、脫細胞小腸黏膜下層和脫細胞羊膜的制備：將新鮮豬空腸用清水反復沖洗，去除外面的漿膜層和肌層，翻轉后，去除黏膜層，用NaOH—HCL聯(lián)合方法去細胞處理，PBS反復漂洗，冷凍干燥，分裝密封，過氧乙酸消毒—70度冰箱儲存?zhèn)溆?。取健康剖腹產(chǎn)的人羊膜，生理鹽水沖

6、凈血跡，反復漂洗。0.5％SDS，37度震蕩過夜，0.25％胰酶消化2小時，反復PBS漂洗，冷凍干燥分裝密封，過氧乙酸毒，—70度冰箱儲存?zhèn)溆谩?2、透射掃描電鏡觀察制作的生物支架材料表面情況和孔徑大小。 3、SD大鼠全層皮膚缺損模型的建立：SD大鼠24只，在兩側背部各做1個直徑為1.8cm圓形全層皮膚缺損。創(chuàng)面隨機分為A組、B組和C組。生理鹽水沖洗后，A組HAM覆蓋，B組SIS覆蓋，C組紗布覆蓋。 4、用免疫組

7、織化學染色法觀察各組大鼠皮膚修復中K19陽性細胞的分布和VEGF表達情況。 5、RT-PCR檢測各實驗組兩周時VEGFmRNA的表達情況。 6、結合圖像采集分析系統(tǒng)，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。 結果: 1、兩種支架材料其表面積容積比足夠大，保證大量細胞能夠迅速長入。孔隙率在6

8、0-80％，合適的孔隙大小以及適當?shù)目紫堕g連接結構能夠提高細胞從周圍組織長入的速度和有效性。 2、宿主的K19陽性細胞在兩種支架材料中的浸潤較多，有利于傷口的愈合。 3、兩種支架材料修復的大鼠皮膚缺損中血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達都強于對照組，且脫細胞羊膜組的血管內(nèi)皮生長因子的表達強于脫細胞小腸黏膜下層。 結論: 有基底膜存在的脫細胞羊膜增加了SD大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合中K19陽性細胞的數(shù)目，增強了的真皮中血管內(nèi)