糞腸球菌ZD34菌株(Enterococcus faecalis ZD34)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的生物學(xué)研究.pdf

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文糞腸球菌ZD34菌株（EnterococcusfaecalisZD34）產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的生物學(xué)研究姓名：伍先紹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：賀稚非20090601兩南人學(xué)碩十學(xué)何論文的生長(zhǎng)穩(wěn)定期可達(dá)劍晟人的生物活性。3按優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件，按2％(v／v)的接種量接種菌齡為10h的EfaecalisZD34菌株種子發(fā)酵液于改良CM培養(yǎng)基中，34“C靜止培養(yǎng)28h后12000rpm離心5min制備發(fā)酵上清液，

2、用55％的硫酸銨飽和濃度沉淀拮抗物質(zhì)，4“C放置過夜后12000rpm離心10min，用含20mmol／LNaCI的02mol／L醋酸鹽緩沖液(pH5O)洗滌沉淀，即收集到含拮抗物質(zhì)的粗提液。將含拮抗物質(zhì)的粗提液上CM52離子交換色譜柱(25crux20era)，用含o~10m01]LNaCI的02mol／L醋酸鹽緩沖液(pH5O)，每隔01mol／LNaCI梯度進(jìn)行步進(jìn)式洗脫，在含04mol／LNaCI的O2mol／L醋酸鹽緩沖液(p

3、H5O)的洗脫管中得到一個(gè)活性峰。將有最大活性的洗脫液合并，可用分子截留量為1000Da的透析袋濃縮或用80％的硫酸銨飽和濃度沉淀過夜后12000rpm離心15rain，用無菌去離子水洗滌沉淀濃縮回收拮抗物質(zhì)。濃縮回收的拈抗物質(zhì)上SephadexG25凝膠過濾色譜進(jìn)一步純化，用無菌去離子水洗脫，得到一個(gè)活性峰。經(jīng)Tricine—SDSPAGE電茫：，析，試驗(yàn)結(jié)果表明拈抗物質(zhì)的分f量在3000Da左右。4反相高效液相色譜層析(RPHPLC

4、)再進(jìn)一步分離純化SephadexG25凝膠過濾色譜層析收集的活性峰。實(shí)驗(yàn)在HypersilQDS2柱(C18)(46mmx250mill，伊力特，中國(guó))上進(jìn)行；應(yīng)用流動(dòng)相：A相為95％乙腈01％三氟乙酸，B相為5％乙腈01％三氟乙酸：40min內(nèi)A相跑梯度從40％至100％；流速為lml／mim檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。RPHPLC試驗(yàn)結(jié)果表明拮抗物質(zhì)基本上得到了純化。拮抗物質(zhì)的出峰保留時(shí)間為10405min。收集峰尖部分，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法

5、(ESIMS／MS)檢測(cè)分析，確定拈抗物質(zhì)的分子量約為3434Da。5拮抗物質(zhì)的理化性質(zhì)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，拮抗物質(zhì)耐pHl～13：100“C處理10min活性基本不變，100“C處理60min仍有活性，但是有很人降低，表明該拮抗物質(zhì)有很好的穩(wěn)定性。拮抗物質(zhì)經(jīng)蛋白酶E(37℃，pH70)、蛋白酶K(37℃，pH70)和胰蛋白酶(30℃，pH7O)處理6h后均失活，進(jìn)一步確定該拮抗物質(zhì)為細(xì)菌素。關(guān)鍵詞：EfaecalisZD34拮抗物質(zhì)分子