表面蛋白EF0591對致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05部分生物學特性影響的研究.pdf

1、腸球菌是一種條件致病菌，常棲居于人和動物消化道內，腸球菌不僅能引起人類感染，而且豬、牛、羊、禽、貓、犬等也是易感動物，并且能在人與動物之間水平傳播。當人體免疫力低下或腸球菌定植部位改變時，能引起人類疾病，如菌血癥、尿路感染、肝膽膿毒癥、心內膜炎、外科傷口感染、牙髓感染、新生兒膿血癥等甚至危及生命。腸球菌的致病性與其毒力因子密切相關，有研究表明，當腸球菌缺少某些毒力因子時,其毒力將大大降低。因此，研究腸球菌的毒力因子對研究腸球菌的致病機制

2、具有重要的意義。EF0591是新近發(fā)現(xiàn)的一種毒力因子，有研究證明它與臨床分離株密切相關，但是人們關于它毒力及作用機制還知之甚少。本研究以致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05（E. faecalis XJ05）為親本株，構建EF0591基因突變株（E. faecalis XJ05-△0591），培養(yǎng)HeLa及小鼠RAW264.7細胞，觀察突變該基因后對HeLa細胞的粘附能力、小鼠RAW264.7細胞的侵染能力、小鼠主要臟器的載菌能力以及對生物膜形成

3、能力的影響。發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05在細胞黏附、侵染能力方面都比E. faecalis XJ05-△0591強；E. faecalis XJ05在小鼠肝、心、腎、脾內的載菌量均顯著多于E. faecalis XJ05-△0591，在腦中無明顯變化；E. faecalis XJ05生物膜的形成量較E. faecalis XJ05-△0591多，且形態(tài)結構更加致密。
　　主要研究內容及結果如下：
　　1、E. fae

4、calis XJ05 EF0591基因突變株的構建：應用同源重組技術，利用PCR擴增出用于突變 E. faecalis XJ05 EF0591基因片段，酶切、回收該基因片段，并與酶切的穿梭質粒進行連接，電轉化至感受態(tài)的E. faecalis XJ05中。應用卡那霉素抗性篩選出陽性轉化子，并采用PCR等方法進行鑒定。最終成功得到基因突變株E. faecalis XJ05-△0591，經(jīng)過37℃連續(xù)傳代培養(yǎng)檢測證明該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定

5、性。
　　2、EF0591在E. faecalis XJ05的細胞黏附、侵染及小鼠臟器載菌量影響研究：向培養(yǎng)好的HeLa細胞中加入菌懸液孵育1h和2h，裂解細胞后進行計數(shù)；向培養(yǎng)好的RAW264.7細胞中加入菌懸液，培養(yǎng)1h后加入雙抗，繼續(xù)培養(yǎng)3h和24h，裂解細胞后進行計數(shù)；將制備好的菌懸液腹腔注射小鼠，在不同時間取小鼠，取肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦組織進行勻漿，勻漿液涂平板計數(shù)。以野毒株為對照，E. faecalis XJ05

6、-△0591對HeLa細胞黏附數(shù)量下降，統(tǒng)計學比較差異顯著（P＜0.05）。對小鼠RAW264.7細胞的侵染數(shù)量下降，統(tǒng)計學比較差異顯著（P＜0.05）。E. faecalis XJ05-△0591在小鼠肝小葉、心臟、脾臟和腎臟中的載菌量下降，統(tǒng)計學比較差異顯著（P＜0.05）；在腦組織中細菌數(shù)量有變化，但差異不顯著。
　　3、EF0591對E. faecalis XJ05生物膜形成影響的研究：E. faecalis XJ05-△

7、0591及E. faecalis XJ05親本株分別在相同條件下、于96孔板中、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)PBS清洗并干燥，結晶紫染色后測其不同時間點的OD595值。將突變株和野毒株置于放有細胞爬片的六孔板中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別用結晶紫和FITC-ConA及PI染液染色，在光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察不同時間點的生物膜。在不同時間所測得的OD595值顯示，E.faecalisXJ05-△0591形成的生物膜在6h形成明顯，24h

8、達到最大，24h后逐漸開始降解，各個時間點的生物膜形成量都明顯低于E. faecalis XJ05親本株，且差異顯著（P＜0.05）。光學顯微鏡觀察E. faecalis XJ05-△0591及E. faecalis XJ05形成的生物膜形態(tài)發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05形成的生物膜網(wǎng)狀結構較多，形態(tài)較致密，膜內細菌數(shù)也更多。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)E. faecalis XJ05與E. faecalis XJ05-△0591相比