羔羊腦炎腸球菌asa1、ace和esp基因原核表達及在不同動物腸球菌中的分布研究.pdf

1、腸球菌(Enterococcus)為革蘭氏陽性球菌，是人和動物腸道正常菌群重要成員之一。醫(yī)學臨床研究已證明了腸球菌的致病性。腸球菌屬共包括16個種，從臨床標本分離的腸球菌以糞腸球菌和屎腸球菌多見。腸球菌之所以能引起感染在于其擁有眾多的毒力因子和獨特的耐藥機制。在腸球菌眾多毒力因子中聚集物質(asa1)、膠原蛋白黏附素(ace)、腸球菌表面蛋白(esp)都屬于黏附素家族，與腸球菌的黏附和定植有關，而黏附和定植是細菌致病的前提。自2002年

2、以來，新疆生產(chǎn)建設兵團部分規(guī)?；驁霭l(fā)生了由腸球菌引起的羔羊腦炎，羔羊的病死率達20％左右，而對該病的防治缺乏有效手段。本研究以致羔羊腦炎腸球菌為研究對象，對asa1、ace和esp 3種表面蛋白毒力因子基因進行克隆及序列分析、構建其原核表達載體，調查3種毒力因子基因在不同來源腸球菌中的分布，并進行序列同源性分析，以期為動物腸球菌感染的免疫預防、有效診斷以及致病機制的研究奠定基礎。
　　 1.以致羔羊腦炎腸球菌基因組DNA為模板

3、，PCR擴增毒力因子asa1、ace和esp基因的部分片段，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體上，通過PCR和雙酶切鑒定后進行序列測定。測序結果與GenBank上的醫(yī)學臨床腸球菌的相應序列進行同源性分析。結果顯示：asa1基因同源性在95.5％以上，ace基因同源性在97.8％以上，esp基因同源性在98.9％以上。
　　 2.通過基因重組技術將致羔羊腦炎腸球菌毒力因子asa1、ace和esp結構基因的部分片段克隆入原核表達載

4、體pET-28a(+)，將該重組質粒轉化E.coli BL21，IPTG誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析及Western blot檢測。結果顯示重組質粒經(jīng)IPTG誘導后表達出分子量分別為26 kDa、38 kDa和41 kDa的蛋白，Western blot檢測顯示單一條帶。結果表明：成功構建了致羔羊腦炎腸球菌毒力因子asa1、ace和esp基因的重組表達載體，表達出的重組蛋白具有反應原性。
　　 3.對來自新疆生產(chǎn)

5、建設兵團128團牛場、129團牛場、130團牛場、克拉瑪依豬場及143團雞場健康動物的肛拭和水源進行檢測，利用常規(guī)細菌分離方法和腸球菌高保守的tuf基因設計的特異性引物對分離株進行PCR檢測。檢測364個樣本，共分離腸球菌192株。其中，克拉瑪依豬場肛拭分離率41.6％(32/77)，水樣中未分離到；128團牛場分離率16％(8/50)，水樣分離到1株；129團牛場分離率77.7％(56/72)，水樣分離到2株；130團牛場肛拭分離率4

6、6％(25/54)，水樣中分離到1株。143團雞場分離率70.5％(67/95)。
　　 4.根據(jù)GenBank公布的腸球菌的毒力因子asa1、ace和esp基因序列設計引物，分別檢測來源于牛、羊、豬和雞的腸球菌分離株(共266株)中相應的毒力因子基因分布情況，并對不同動物來源腸球菌中3種毒力因子基因克隆測序及序列同源性分析。結果顯示：腸球菌3種毒力因子基因在來源于牛、羊、豬和雞的266株腸球菌中平均檢出率分別為14.7％(39