腸球菌屬細(xì)菌素的篩選及其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá).pdf

1、腸球菌屬于乳酸菌，是人和動(dòng)物腸道及部分食品的重要微生物菌群，它能夠產(chǎn)生稱為腸球菌素的抗菌肽。由于腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素不僅能夠抑制與其相關(guān)的菌群還能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性致病菌和食源致病菌，因此，它們有望應(yīng)用在動(dòng)物飼料添加劑和天然食品保鮮劑中。本研究擬從我室分離保存的具有益生特性的腸球菌中，進(jìn)一步篩選產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌素菌株，并對(duì)其細(xì)菌素抑菌特性研究，為開(kāi)發(fā)新型微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。
　　 通過(guò)對(duì)屎腸球菌HDRsEf1抑菌譜的測(cè)定確定金黃色

2、葡萄球菌作為指示菌。瓊脂覆蓋試驗(yàn)顯示，11株試驗(yàn)菌株中有5株菌腸球菌有明顯的抑菌效果，結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)常見(jiàn)的腸球菌素基因進(jìn)行檢測(cè)，最終篩選出兩株產(chǎn)EnterocinL50的腸球菌分別為屎腸球菌Wsg09和糞腸球菌T-12。產(chǎn)細(xì)菌素腸球菌的生長(zhǎng)曲線、pH和抑菌圈曲線顯示，菌株生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)酸，培養(yǎng)30h時(shí)細(xì)菌素活性達(dá)到最大。
　　 從產(chǎn)細(xì)菌素菌株的野生質(zhì)粒上成功擴(kuò)增到了entL50基因，證明該細(xì)菌素是由質(zhì)粒DNA編碼，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連

3、接到pMD18-T載體上，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD-L50測(cè)序分析，與登錄號(hào)FJ618564.1的基因序列同源性達(dá)到100％。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了蛋白相關(guān)特性和結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，EnterocinL50是由A和B兩個(gè)小肽組成，均具有與靶細(xì)胞膜互作的重要特征即呈陽(yáng)離子特性，有高度的α螺旋結(jié)構(gòu)。
　　 為促進(jìn)足量的EnterocinL50產(chǎn)生和便于其純化，我們選用大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)。將兩個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a

4、-L50A和pET28a-L50B分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白His-Ent.L50A及在分子伴侶作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的His-Ent.L50B均為可溶性。利用親和層析從細(xì)胞裂解產(chǎn)物上清中純化His-Ent.L50A和His-Ent.L50B。純化產(chǎn)物抑菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示His-Ent.L50A和B具有協(xié)同作用，對(duì)單增李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，MIC和MBC結(jié)果證明His-