乳酸片球菌素pedA基因的克隆與表達(dá).pdf

1、細(xì)菌素作為一種天然生物防腐劑，用于食品防腐以提高食品安全性和延長(zhǎng)食品貨架期。為解決天然菌株細(xì)菌素產(chǎn)量較低的問(wèn)題，本課題采用基因工程技術(shù)，克隆乳酸片球菌的片球菌素pedA基因，建立大腸桿菌片球菌素基因pedA表達(dá)系統(tǒng)，以期獲得片球菌素的高效表達(dá)。
　　以乳酸片球菌基因組為模板，采用PCR法，擴(kuò)增出了片球菌素的結(jié)構(gòu)基因pedA。將擴(kuò)增的pedA基因連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。提取含有pedA基因的pMD18-T重

2、組質(zhì)粒，BglII和XholI雙酶切獲得pedA基因，與經(jīng)同樣雙酶切后的表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)連接，先后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21(DE3)，用PCR法篩選陽(yáng)性克隆菌株后，選取其中的一株陽(yáng)性克隆菌株，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行pedA基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該重組質(zhì)粒含有pedA基因，其核苷酸序列與NCBI公布的片球菌素pedA基因（GenBankAY083244）同源性為100％。該菌株在含有1mmol/LIPTG的培養(yǎng)基中，37℃培

3、養(yǎng)4小時(shí)后，高效表達(dá)了預(yù)期大小的22kDa硫氧還蛋白和片球菌素的融合蛋白。
　　重組菌培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后離心，分別取上清和沉淀物用SDS-PAGE進(jìn)行分析，由于在沉淀物SDS-PAGE電泳結(jié)果中有預(yù)期大小的融合蛋白條帶，表明表達(dá)的蛋白為包涵體。為獲得有活性的表達(dá)產(chǎn)物，將提取的包涵體充分洗滌，用含有谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的復(fù)性緩沖液處理，促進(jìn)蛋白正確折疊復(fù)性。由于表達(dá)的融合蛋白含有His-tag，復(fù)性后的蛋白質(zhì)通過(guò)Ni-IDA親和重力

4、柱分離純化，在500mmol/L咪唑濃度下洗脫得到單一蛋白條帶，純化的蛋白濃度在0.4-0.7mg/mL。純化的蛋白質(zhì)經(jīng)腸激酶酶切后，SDS-PAGE電泳出現(xiàn)兩個(gè)蛋白條帶，其中一個(gè)與片球菌素分子量相近，另一個(gè)與硫氧還蛋白的分子量相近。
　　純化的蛋白質(zhì)經(jīng)腸激酶酶切后，牛津杯法測(cè)定酶切產(chǎn)物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌具有抑制作用，表明本試驗(yàn)建立的pedA基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)片球菌素融合蛋白，經(jīng)包涵體復(fù)性、融合蛋白