Nisin基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)及其發(fā)酵條件的研究.pdf

1、乳鏈菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)產(chǎn)生的羊毛硫氨酸類(lèi)細(xì)菌素，對(duì)芽孢、多種革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)人體安全無(wú)毒，在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)中有較好的應(yīng)用前景。目前，nisin的生產(chǎn)菌株大都是通過(guò)天然菌株的篩選或誘變獲得，其活力的提高和功能的改造受到一定的限制。因此，本研究在克隆nisA的基礎(chǔ)上，利用DNA重組技術(shù)獲得產(chǎn)nisin的重組乳酸乳球菌工程菌株，并優(yōu)化了其發(fā)酵條件。主

2、要研究結(jié)果如下：
　　 (1)以含有nisin前體基因(nisA)的重組克隆載體pUCm—T/LNI為模板(本實(shí)驗(yàn)室保存)，設(shè)計(jì)一對(duì)分別含有NcoI、XbaI的表達(dá)引物，對(duì)nisin基因進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建重組克隆載體pUCm—T/Nis。序列測(cè)定表明，亞克隆得到的nisin基因序列與原基因一致。
　　 (2)pUCm—T/Nis經(jīng)Nco I和.Xba I雙酶切，與經(jīng)相同酶切的乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ80連接，轉(zhuǎn)化E.col

3、i MC1061感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，篩選獲得含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌。提取重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌L.lactis LZ(nisA缺失株)，篩選得到含重組質(zhì)粒pNZ80/Nis的基因工程菌—L.lactis NIP。抑菌試驗(yàn)表明，L.lactis NIP發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽胞桿菌、李斯特桿菌等(G+菌)及嗜水氣假單孢菌(G—菌)都有明顯的抑菌效果。
　　 (3)L.lactisNIP的發(fā)酵條

4、件優(yōu)化結(jié)果表明，產(chǎn)nisin的最佳發(fā)酵氮源、碳源和磷源分別是酵母粉、麥芽糖和磷酸氫二鉀，添加量分別是1.5％、1.5％和3％；發(fā)酵最適初始pH為6.5，最適培養(yǎng)溫度是28℃，發(fā)酵時(shí)間為14h，在上述優(yōu)化條件下，L.lactis NIP發(fā)酵上清液中目的蛋白的抗菌活力(nisin效價(jià))達(dá)到最高值5040IU/ml，比非優(yōu)化條件下的效價(jià)提高了404％。
　　 以上結(jié)果為提高nisin產(chǎn)量和降低nisin生產(chǎn)成本提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步深入