乳酸乳球菌發(fā)酵稀奶油過程中甲基酮的合成代謝調(diào)控.pdf

1、甲基酮是一類重要的發(fā)酵乳制品風(fēng)味物質(zhì)，也是重要的香料及合成香料的中間體?；瘜W(xué)合成的甲基酮風(fēng)味單一，與乳制品需要的天然甲基酮風(fēng)味相差甚遠(yuǎn)，因此微生物發(fā)酵合成甲基酮是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。乳酸乳球菌乳酸亞種是乳制品發(fā)酵工業(yè)中重要的發(fā)酵劑，也是最為常用的誘導(dǎo)表達(dá)型宿主菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究表明乳酸乳球菌乳酸亞種對(duì)于發(fā)酵乳制品中甲基酮的產(chǎn)量有重要影響，但是目前乳酸乳球菌乳酸亞種甲基酮合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本論文研究不同培養(yǎng)基成分和發(fā)酵

2、條件下乳酸乳球菌乳酸亞種甲基酮合成途徑關(guān)鍵酶活力的變化，從酶學(xué)水平闡述乳酸乳球菌乳酸亞種在不同培養(yǎng)條件下，甲基酮合成代謝體系的響應(yīng)及細(xì)胞自身的代謝調(diào)控機(jī)理，完善乳酸乳球菌乳酸亞種甲基酮合成代謝調(diào)控機(jī)制理論。
　　使用SPME-GC-MS技術(shù)分析稀奶油及其發(fā)酵產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)，稀奶油中共檢出21種揮發(fā)性物質(zhì)，主要為揮發(fā)性脂肪酸、甲基酮類、內(nèi)酯和其他一些揮發(fā)性化合物。乳酸乳球菌發(fā)酵稀奶油共檢出15種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為4種脂肪酸和4種

3、甲基酮。經(jīng)過揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對(duì)含量的分析證明乳酸乳球菌具有提高發(fā)酵稀奶油甲基酮產(chǎn)量的能力。通過主成分分析、相對(duì)氣味活度值（ROAV）和感官評(píng)價(jià)確定乳酸乳球菌乳酸亞種單獨(dú)發(fā)酵稀奶油關(guān)鍵風(fēng)味化合物有5種：2-十一烷酮、2-壬酮、壬醛、庚醛、己醛（ROAV≥1），同時(shí)，丁酸、己酸、2-十三烷酮、2-庚酮對(duì)總體風(fēng)味發(fā)揮著重要的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。
　　乳酸乳球菌乳酸亞種進(jìn)行甲基酮合成主要是在穩(wěn)定期進(jìn)行的。棕櫚酸可以抑制乳酸

4、乳球菌的生長(zhǎng)，同時(shí)可以誘導(dǎo)β-氧化能力，證明β-氧化能力是乳酸乳球菌抵抗脂肪酸抑菌作用的應(yīng)激機(jī)制。通過檢測(cè)到脂酰-CoA脫氫酶、烯脂酰CoA水合酶、β-羥脂酰-CoA脫氫酶、硫解酶和硫酯酶的活力，證明乳酸乳球菌乳酸亞種中存在β-氧化途徑及硫酯酶，結(jié)合文獻(xiàn)資料和氣質(zhì)分析數(shù)據(jù)，以及結(jié)合底物和營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)甲基酮合成途徑的影響，證明乳酸乳球菌乳酸亞種合成甲基酮的主要途徑是不完全β-氧化途徑。
　　棕櫚酸能夠誘導(dǎo)乳酸乳球菌乳酸亞種β-氧化能力

5、，但是誘導(dǎo)能力有所不同。在30℃、pH6～7培養(yǎng)條件下可以獲得較高的乳酸乳球菌乳酸亞種β-氧化能力。可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和半乳糖）可以保持或者抑制硫解酶的活力，有利于調(diào)控甲基酮的產(chǎn)生。Ca2+和Mg2+可以誘導(dǎo)脂酰-CoA脫氫酶的活力，但是1 mmol/L-Fe2+或者12 mmol/L-Mg2+抑制脂酰-CoA脫氫酶的活力。Mg2+、Ca2+、Fe2+和Cu2+能夠誘導(dǎo)烯脂酰-CoA水合酶的活力，抑制β-羥脂酰-CoA脫

6、氫酶的活力，誘導(dǎo)硫解酶的活力。乳酸乳球菌在不同培養(yǎng)條件下fadA基因的表達(dá)量差異顯著（p<0.05），其中鈣處理?xiàng)l件下的表達(dá)量是正常培養(yǎng)條件下的3.02倍，果糖處理?xiàng)l件下的表達(dá)量是正常培養(yǎng)條件下的28.71倍。
　　中短鏈脂肪酸（辛酸 C8:0）和長(zhǎng)鏈脂肪酸（棕櫚酸 C16:0）可以刺激乳酸乳球菌硫酯酶的活力。果糖可以顯著誘導(dǎo)硫酯酶的活力，抑制硫解酶的活力。根據(jù)關(guān)鍵酶活力之間的相關(guān)性和回歸分析，可溶性糖和銅離子獲得的硫酯酶和烯脂酰

7、-CoA水合酶活力變化呈顯著相關(guān)性（p＜0.05）。Mg2+、Ca2+、Fe2+和Cu2+都可以抑制硫酯酶的活力。鈣離子濃度與硫解酶活力之間有顯著的相關(guān)性。經(jīng)果糖、鈣離子和棕櫚酸調(diào)控的乳酸乳球菌乳酸亞種發(fā)酵稀奶油后，與未經(jīng)調(diào)控的菌種相比，甲基酮的總相對(duì)含量是對(duì)照組的1.29倍，研究結(jié)果表明，通過對(duì)甲基酮合成過程中關(guān)鍵酶的調(diào)控，可以顯著地提高乳酸乳球菌乳酸亞種代謝合成甲基酮的能力。
　　因此，脂肪酸、發(fā)酵條件、可溶性糖類和金屬離子可