片球菌素PediocinPA-1在原核表達系統(tǒng)的構建及表達純化.pdf

1、目的:利用分子生物學和細胞生物學技術構建編碼乳酸pediocinPA-1基因片段的原核表達載體，誘導表達，鑒定表達產物，并對表達產物進行純化。為探索天然乳酸pediocinPA-1的生物學活性及應用奠定基礎。 方法:根據文獻報道的序列設計引物，通過PCR技術特異性擴增PediocinPA-1的成熟肽pedA基因編碼片段，并將其克隆入原核表達載體pET-32b(+)中，構建重組質粒pET-32b(+)/pedA。經限制性內切酶kp

2、nⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定和DNA序列測定后，將重組質粒轉化大腸桿菌，經IPTG誘導表達組氨酸融合蛋白。SDS-PAGE與Westernblot電泳鑒定表達產物，用鎳離子親和層析的方法對表達產物進行純化。 結果:PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示約1.50bp的條帶，與預期大小一致。重組質粒轉入大腸桿菌BL21，篩選出陽性克隆，質粒提取后雙酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到兩條大小分別為150bp和5.9kb的電泳條帶，與

3、pedA基因和pET-32b(+)質粒片段大小相符。大腸桿菌工程菌，在IPTG誘導下表達分子量為19kDa左右的融合蛋白。SDS-PAGE分析顯示，表達的蛋白主要以可溶的形式存在于菌體裂解液上清組分中，表達量為25％。用鎳離子親和層析的方法純化后行SDS-PAGE，目的蛋白呈單一條帶，薄層掃描分析證明，純度達90％。 結論:成功構建了原核表達載體pET-32b(+)/pedA，pedA基因片段編碼的PediocinPA-1能在原