重組溶葡萄球菌蛋白的原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(金葡菌)是社區(qū)和醫(yī)院感染的主要病原菌，由于抗生素的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了大量難治的耐藥菌群，常規(guī)抗生素對耐藥金葡菌所致的感染已經(jīng)沒有治療效果，目前以萬古霉素為代表的糖肽類抗生素是治療耐藥金葡菌感染最有效的藥物，但萬古霉素毒性大，限制了其在臨床的大量使用。而且，自1996年至今，全球范圍內(nèi)已報(bào)道多例對萬古霉素耐藥(VRSA)或中介耐藥(VISA)的病例。針對金葡菌日益增強(qiáng)的耐藥性，而抗生素療效愈來愈下降的迫切現(xiàn)狀，如何研發(fā)更有效

2、的藥物治療金葡菌感染，同時減輕藥物毒性和防止耐藥性的產(chǎn)生已成為抗感染治療亟待解決的問題。 溶葡萄球菌酶(lysostaphin)的發(fā)現(xiàn)給耐藥金葡菌感染的治療帶來了希望。它是從模仿葡萄球菌(staphylococctls simulans)中分離出來的一種含鋅的金屬蛋白酶，能特異性水解細(xì)菌胞壁肽聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)Gly五肽橋聯(lián)而產(chǎn)生破壁溶菌作用。由于Gly五肽橋聯(lián)結(jié)構(gòu)僅大量存在于葡萄球菌細(xì)胞壁，其中又以金葡菌細(xì)胞壁中分布最廣，因此，溶葡

3、球菌酶主要對葡萄球菌，尤其對金黃色葡萄球菌有強(qiáng)大的殺滅作用。與抗生素干擾細(xì)菌的生長期不同，溶葡球菌酶的破壁活性不受細(xì)菌生長周期影響，對靜止和活動期葡萄球菌均有殺滅作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性。這些特性使之成為國內(nèi)外專家研發(fā)抗耐藥金葡菌制劑的重點(diǎn)目標(biāo)之一。但是由于天然的溶葡萄球菌酶產(chǎn)量少，難以純化，限制了人們對其進(jìn)行深入的研究和開發(fā)。直到20世紀(jì)90年代，隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)純化技術(shù)的發(fā)展，人們才逐漸建立了一些重組溶葡萄球菌酶的表達(dá)系統(tǒng)，

4、但是仍然存在以下問題，有待進(jìn)一步優(yōu)化和完善：①表達(dá)蛋白無生物學(xué)活性或活性很低，有的重組蛋白比天然溶葡萄球菌酶活性低10-16倍：②重組蛋白的產(chǎn)量不理想；③蛋白純化方法煩瑣，時間長，純化過程導(dǎo)致重組蛋白的生物活性丟失，表達(dá)蛋白只適用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)晶學(xué)研究；④對表達(dá)蛋白的酶活性研究僅僅限于酶活力單位的測定；⑤溶葡萄球菌酶的空間結(jié)構(gòu)和酶分子特性仍然不明確。這些問題阻礙了人們對溶葡萄球菌酶在人體內(nèi)應(yīng)用的安全性、有效性和穩(wěn)定性進(jìn)行深入的研究，這極

5、大地限制了溶葡萄球菌酶的開發(fā)和應(yīng)用。鑒于以上的問題，我們選用了目前表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的pET系統(tǒng)，在大腸埃希菌中表達(dá)重組溶葡萄球菌蛋白，摸索優(yōu)化條件以提高蛋白產(chǎn)量，并對表達(dá)蛋白的酶活性進(jìn)行了更加深入的研究，測定了其抗菌譜，比較了其與萬古霉素等臨床常用抗生素的抗菌效力，最后檢測了影響重組蛋白酶活力的因素，初步分析了其酶分子特性。 本課題研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1．構(gòu)建原核表達(dá)載體和優(yōu)化表達(dá)目標(biāo)蛋白：我們以pRG質(zhì)粒

6、為模版，通過PCR選擇性地?cái)U(kuò)增溶葡萄球菌酶基因，雙酶切后與載體pET-42a(+)連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并經(jīng)基因測序證實(shí)結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pET421ys。本研究選用的pET原核表達(dá)系統(tǒng)是目前在大腸埃希菌(E-coli)中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)，蛋白表達(dá)由宿主菌提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)，非誘導(dǎo)條件下則不存在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，從而使克隆與表達(dá)很好的分離。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚩寺∪胼d體后，重組質(zhì)粒首先選用不含有

7、T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)進(jìn)行克隆，這就避免了對宿主細(xì)胞有毒的蛋白產(chǎn)物對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；完成克隆后，將其轉(zhuǎn)入染色體上帶有l(wèi)acUV5調(diào)控的T7RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主菌BL21(DE3)plysS中，用IPTG誘導(dǎo)即可表達(dá)目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)需要大量的目標(biāo)蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，我們對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，摸索到的最佳表達(dá)條件為：25℃誘導(dǎo)6h，IPTG濃度為1mmol/L。用Bio-Rad Quantitv One軟件分析

8、，重組蛋白表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的40％，高于文獻(xiàn)報(bào)道的20％。目標(biāo)蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，少量為可溶性表達(dá)，這和文獻(xiàn)報(bào)道中均以可溶蛋白表達(dá)的結(jié)果不同，形成包涵體的原因可能是表達(dá)效率太高所致。 2．重組溶葡萄球菌蛋白的純化、復(fù)性及鑒定：本研究選用了固定化金屬離子親和層析法(IMAc)純化蛋白，它的優(yōu)點(diǎn)是金屬離子配基具有很好的穩(wěn)定性，吸附量大，成本低，純化時間短，但也有會發(fā)生非特異性吸附的缺點(diǎn)?？扇艿鞍椎募兓Ч焕硐?，純度僅為

9、80％，說明針對可溶蛋白的最佳純化方案還有待于進(jìn)一步摸索。包涵體獲得了較高的純化效率，純度在95％以上，BCA法蛋白定量測得純化后可溶蛋白的濃度為1151.53 μg/ml，包涵體濃度為1869.54 μg/ml。1L菌液純化后獲得15.34mg重組蛋白，產(chǎn)量高于文獻(xiàn)報(bào)道的11mg。包涵體需要復(fù)性后才能恢復(fù)蛋白的生物學(xué)活性，本實(shí)驗(yàn)選用了最常用的透析復(fù)性方法。利用免疫印跡法分析鑒定純化后蛋白，目標(biāo)蛋白與抗His．Tag單克隆抗體反應(yīng)，在分

10、子量約27kDa處出現(xiàn)特異表達(dá)的蛋白條帶，與預(yù)測基本一致，結(jié)果顯示成功獲得了較高純度的重組溶葡萄球菌蛋白。 3．重組溶葡萄球菌蛋白體外抗菌活性的研究：通過對重組溶葡萄球菌蛋白抗菌譜的初步測定，發(fā)現(xiàn)其對肺炎球菌、白色念珠菌及銅綠假單胞菌等11種33株臨床分離株均沒有殺菌效力，僅對葡萄球菌有殺菌活性，但對金葡菌的殺菌活性顯著大于其它葡萄球菌。我們采用微量稀釋法測定了重組溶葡萄球菌蛋白對金葡菌的體外抗菌效力，結(jié)果證實(shí)，重組溶葡萄球菌蛋

11、白有強(qiáng)大的殺菌活性，不僅對金葡菌敏感株有良好的抗菌作用，對臨床上難治的MRSA的殺菌效果也非常突出，MIC在0.003～0.78 μg/ml之間，MBC在0.39～3.125 μg/ml之間。與傳統(tǒng)抗生素比較，重組蛋白的抗菌活性不僅顯著優(yōu)于新青Ⅱ和克林霉素，還優(yōu)于目前殺菌效果最好的萬古霉素。我們采用分光光度法測得重組溶葡萄球菌蛋白比活力是10150u/mg，這和文獻(xiàn)報(bào)道的970～11900 u/mg接近。酶活力越高，酶催化某一反應(yīng)的速度

12、就越快，而比活力越高，表明酶越純，因此可以認(rèn)為重組溶葡萄球菌蛋白純度高，抗菌活力強(qiáng)，這進(jìn)一步印證了本實(shí)驗(yàn)關(guān)于重組溶葡萄球菌蛋白具有強(qiáng)大的體外抗菌活性的研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)純化后的包涵體不僅有抗菌活性，而且大于可溶蛋白的活性，復(fù)性后包涵體卻無殺菌活性。這不同于“包涵體需要復(fù)性才能恢復(fù)活性”的傳統(tǒng)理論。而最近的研究結(jié)果顯示，在包涵體中的蛋白質(zhì)不全是非天然狀態(tài)，包涵體中存在的一些小分子熱激蛋白質(zhì)(IbpAB)使某些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)依然維持了原

13、有的立體結(jié)構(gòu)和活性。本研究的結(jié)果也推測，包涵體并不全是因錯誤折疊形成的無用的副產(chǎn)物，仍然有一些包涵體蛋白具有天然的結(jié)構(gòu)和活性。包涵體復(fù)性后無抗菌活性的問題可能是未摸索出包涵體復(fù)性的最佳條件，由于純化后的包涵體已有良好的生物學(xué)活性，因此我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)摸索包涵體的最佳復(fù)性條件。 4．影響重組溶葡萄球菌蛋白活力因素的檢測：目前應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)生物活性多肽的一個重要問題，就是表達(dá)肽的穩(wěn)定性，即在酸、堿環(huán)境，溫度等條件變化時

14、，表達(dá)肽是否仍能夠保持良好的生物活性。我們分析了pH值、底物濃度、孵育溫度和作用時間這四個因素對重組溶葡萄球菌蛋白活力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組溶葡萄球菌蛋白的最適pH值為3～4，在pH值為3～6時，酶活力比較穩(wěn)定，說明重組溶葡萄球菌蛋白耐酸性能好。重組蛋白的最適溫度為50℃，和文獻(xiàn)報(bào)道的45～48℃接近。重組蛋白的酶活力還隨著底物濃度的增加和作用時間的延長而增加，這些性質(zhì)與酶的基本特性相吻合。 綜上所述，我們成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體p