毛竹KdsD蛋白的原核表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、毛竹屬于禾本科竹亞科單子葉植物，其細(xì)胞壁主要成分由纖維素和果膠組成。植物果膠中的2-酮-3-脫氧辛糖酸（KDO）是非常保守的八碳糖，主要通過(guò)KDO合成途徑合成。該途徑中阿拉伯糖-5-磷酸異構(gòu)酶（Arabinose-5-phosphate isomerase，KdsD）[EC:5.3.1.13]是KOD合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵的限速酶。但禾本科毛竹中KdsD的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究以毛竹為研究對(duì)象，進(jìn)行了初步研究，結(jié)論如下；

2、　　1.成功構(gòu)建得到毛竹KdsD蛋白的原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)、表達(dá)，成功獲得了大量重組蛋白的可溶性表達(dá)。
　　2.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析和分子篩層析（SEC）方法進(jìn)行酶蛋白的分離純化步驟，得到純度85％以上的高純度酶;分子篩層析和BN-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后的目的蛋白KdsD在溶液中主要以多聚體、二聚體和單體形式存在，這同微生物來(lái)源KdsD酶在溶液中以四聚體形式存在很大差異；進(jìn)一步使用Western blotting和MA

3、LDI-TOF MASS技術(shù)對(duì)純化的蛋白進(jìn)行鑒定。
　　3.測(cè)定了毛竹KdsD酶學(xué)性質(zhì)，證明該酶催化反應(yīng)的最適pH值為8.5，最適作用溫度為37℃，各種金屬離子在低濃度均對(duì)酶活性存在不同程度的影響作用，金屬離子Zn2+，Ca2+，Mg2+，Co2+對(duì)酶活性有激活作用，K+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Cd2+對(duì)酶活性有抑制作用，其中以Fe2+和Cd2+對(duì)酶活性的抑制作用最強(qiáng)，而金屬離子Cu2+，Se2+，Li+，Na+對(duì)酶活性無(wú)明顯的影響