飛蝗氣味分子結(jié)合蛋白的分離純化原核表達(dá)及生化特征.pdf

1、該文采用生物化學(xué)方法及分子生物學(xué)方法研究了飛蝗Locusta migratoria的氣味分子結(jié)合蛋白(odarant-binding proteins,OBPs)和化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)的生化特性和基因的克隆及表達(dá).利用熒光技術(shù)分析了飛蝗中這兩類蛋白及沙漠蝗Schistocerca gregaria重組CSP(recCSPsg4)的結(jié)合特性,初步探討了OBPs和CSPs的生理功能.主要結(jié)果如

2、下:1.飛蝗中OBP:電泳分析發(fā)現(xiàn)飛蝗雌雄兩性觸角中特異性存在著一類蛋白,其N-端測序及克隆測序表明它屬于氣味分子結(jié)合蛋白.克隆測序獲得飛蝗中的兩條OBP序列(LmigOBP,GenBank登錄號為AF542076),但二者間僅在第19位氨基酸不同,分子量為14.8kDa,等電點(diǎn)為4.7.氨基酸序列中的6個(gè)保守半胱氨酸間以二硫鍵相互連接.根據(jù)已知BombyxmoriPBP的結(jié)構(gòu),模擬得到飛蝗OBP的三維模型,主要由a-螺旋構(gòu)成.構(gòu)建Lm

3、igOBP的原核表達(dá)載體(pET-LmigOBP)并在大腸桿菌(E. coli)中表達(dá).重組蛋白(recLmigOBP)表達(dá)量很高,主要以包涵體形式存在.二硫鍵被破壞后蛋白可溶性增大,經(jīng)過離子交換和凝膠過濾,得到高純度的recLmigOBP.無論天然蛋白還是重組蛋白,都以二聚體的形式存在.這是飛蝗乃至整個(gè)直翅目中首次關(guān)于OBP序列及相關(guān)特性的研究報(bào)道.2.飛蝗中CSP:對飛蝗觸角cDNA文庫進(jìn)行篩選,克隆測序得到15條新的CSP序列(C

4、SPlm,GenBank登錄號為AY149648~AY149662),所得CSP新序列中都具有以二硫鍵順次連接的4個(gè)保守的半胱氨酸.根據(jù)CSPs氨基酸序列間相似性將其分為兩個(gè)亞類CSPlm-Ⅰ和CSPlm-Ⅱ,其分子量在12.2~12.9kDa間,等電點(diǎn)為5.1~6.2.構(gòu)建其中一個(gè)CSP(CSPlm-Ⅱ-10)的表達(dá)載體(pET-CSPlm-Ⅱ-10)并在大腸桿菌中高效表達(dá).經(jīng)過凝膠過濾和離子交換,得到純化的重組CSP(recCSPl

5、m-Ⅱ-10).同時(shí)從飛蝗觸角和翅中分離鑒定出6條CSP序列,用MALDI-MS技術(shù)測定的分子量與克隆測序所得15條蛋白序列的分子量相比較,二者之間相似性低.在飛蝗翅中含有高濃度的CSP,對其進(jìn)行分離純化.且發(fā)現(xiàn)在飛蝗翅中活體中與CSPs結(jié)合在一起的物質(zhì)為油酸酰氨.3.OBP和CSPs在飛蝗過程中地時(shí)空表達(dá):同時(shí)也監(jiān)測了飛蝗LmigOBP,CSPlm-Ⅰ和CSPlm-Ⅱ分別在飛蝗的不同生物型(散居型和群居型)、體軀的不同部位、不同生長發(fā)

6、育期(蝗蝻和成蟲期)的表達(dá).結(jié)果表明OBP僅特異地存在于觸角中,而CSPs較為普遍的存在于蝗蟲軀體不同部位,且不同的CSP亞類表達(dá)部位也有所不同.4.沙漠蝗中CSP的結(jié)合特性:根據(jù)熒光結(jié)合學(xué)說,測定recLmigOBP,recCSPlm-Ⅱ-10及recCSP-sg4與N-苯基萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)的結(jié)合特性,蛋白解離濃度分別為1.7μM,6.2μM和4.0μM.根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1-NP