堿性蛋白酶抑制劑LupI-MSSS的原核表達(dá)、純化及晶體條件初篩.pdf

1、沙雷氏蛋白酶基因在產(chǎn)生該酶基因的菌株基因組中都有一個(gè)抑制該蛋白酶活性的基因位于其上游或者下游。低溫堿性金屬蛋白酶MP是從菌株YS-80-122中提取純化的，屬于沙雷氏蛋白酶家族，與該家族報(bào)道的其他酶的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，氨基酸同源性最高為83％。在MP基因下游有一抑制劑基因lupI，與現(xiàn)有假單胞桿菌蛋白酶抑制劑APRin的氨基酸同源性為55%，該抑制劑可以完全抑制蛋白酶MP的活性。為進(jìn)一步探究N端序列延伸后對(duì)抑制劑活性的影響，在野生型抑制劑基因的

2、基礎(chǔ)上，通過(guò)定點(diǎn)突變將LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本實(shí)驗(yàn)對(duì)抑制劑基因lupI-MSSS在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)；并通過(guò)單因素法和響應(yīng)面法相結(jié)合對(duì)該抑制劑的發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化；同時(shí)對(duì)表達(dá)后的蛋白進(jìn)行了純化以滿(mǎn)足后續(xù)結(jié)晶的純度要求；最后對(duì)抑制劑LupI-MSSS的結(jié)晶條件進(jìn)行了初篩，研究結(jié)果分述如下：
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中的表達(dá)：利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖性O(shè)計(jì)合成兩端引物，以 LupI野生型表達(dá)質(zhì)粒

3、 pET28-lupI為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pET28a-lupI-MSSS原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切后表達(dá)片段約為363 bp，與預(yù)期一致。將表達(dá)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液重懸破碎后留上清，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明該蛋白的大小約11 KDa，與預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量相同，同時(shí)活性測(cè)定也表明表達(dá)的該抑制劑可以完全

4、抑制堿性蛋白酶MP的活性。
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化：采用單因素試驗(yàn)對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)抑制劑LupI-MSSS的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件（初始培養(yǎng)基pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、搖床轉(zhuǎn)速）進(jìn)行了優(yōu)化，并針對(duì)以上七個(gè)因素，利用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出3個(gè)主要影響因子：誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間。利用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)以上三個(gè)主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵表達(dá)

5、條件為：初始培養(yǎng)基pH為7，接種量2%，誘導(dǎo)劑添加時(shí)間2 h，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8.5 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。
　　抑制劑LupI-MSSS的純化：發(fā)酵制備抑制劑粗蛋白液，經(jīng)過(guò)三步純化：超濾、Superdex200凝膠過(guò)濾層析和Q-Sepharose離子交換層析。最終純化得到的樣品純化倍數(shù)為20，回收率為60.7%，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示為單一的目的條帶。通過(guò)H

6、PLC法對(duì)蛋白樣品的純度進(jìn)行鑒定，其純度高達(dá)99.7%，達(dá)到預(yù)期要求，可供后續(xù)結(jié)晶試驗(yàn)使用。
　　抑制劑LupI-MSSS結(jié)晶條件初篩：利用Hampton Research的試劑盒對(duì)抑制劑LupI-MSSS的晶體生長(zhǎng)條件進(jìn)行了初篩。HR2-144 Index試劑盒，20℃培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其中22個(gè)條件下都有晶體生長(zhǎng)，且晶型較一致。挑取狀態(tài)較好的單晶進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有目的條帶存在，說(shuō)明顯微鏡下觀察到的晶體確實(shí)為抑制劑蛋白結(jié)