火菇素cDNA基因的原核表達與重組蛋白的純化及活性研究.pdf

1、火菇素是一種具有抗癌活性的典型的食用菌蛋白類藥物，由日本人KomatsuN.等(1963)首先從金針菇中分離出來?；鸸剿貙π∈笕饬鯯180和艾氏腹水瘤有明顯的抑制作用，且能延長小鼠的生存期。在火菇素的作用下，腫瘤細胞發(fā)生了明顯的病理變化：細胞的有絲分裂受到抑制，細胞核、細胞質中形成空泡，使細胞膨脹破裂，最終導致細胞溶解。毒性實驗研究表明，火菇素對生物機體無明顯的毒副作用。 本論文的主要工作在于火菇素cDNA基因的原核表達，重組

2、蛋白的純化及活性的研究。由于常規(guī)提取火菇素工作量大、周期長、得率低，故而阻礙了其進一步的開發(fā)與應用。利用大腸桿菌高效表達火菇素蛋白能很好的解決了進一步在動物實驗和臨床藥理實驗研究的原料問題。而檢測基因工程菌表達的蛋白同樣具有抑瘤活性是進一步證明可替代常規(guī)提取的火菇素。 將火菇素cDNA基因序列擴增，用雙酶切法將其插入到原核表達質粒pET32a(+)上，然后轉化到大腸桿菌BL2l(DE3)中，篩選陽性克隆，進行質粒雙酶切、DNA測

3、序等鑒定，用10％的甘油保存在-20℃冰箱中。用終濃度為1mmol/L的IPTG在30℃誘導表達蛋白。通過聚丙烯酰胺變性凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在分子量約為38 000Da處有一新生蛋白質條帶，即火菇素重組蛋白。實驗表明重組蛋白以可溶和不可溶兩種形式存在于大腸桿菌中。將大腸桿菌進行超聲波細胞破碎，離心，分別收集上清液和包涵體。將上清液穿過Ni<'+>NTA his bind resin，通過組氨酸和金屬鎳的特異親和特性，將目的蛋白掛在柱上，增加緩沖

4、液中的咪唑濃度再洗脫目的蛋白，達到純化的目的。用West blot實驗證明重組蛋白能與天然火菇素制備的家兔血清免疫結合。將包涵體用低濃度的尿素洗滌，然后用高濃度的尿素完全溶解之，再次高速離心，將上清液穿過Ni<'+>-NTA his bind resin，通過改變層析柱的pH值達到分離純化變性蛋白的目的。收集的洗脫峰采用尿素濃度梯度透析復性。 將火菇素重組蛋白作用于人急性單核細胞性白血病細胞株U937，用倒置顯微鏡、普通光學顯微

5、鏡、激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測重組蛋白作用下的腫瘤細胞的形態(tài)特征和細胞周期。通過將終濃度20μg/ml的火菇素重組蛋白加入到U937細胞培養(yǎng)液中，作用24h后，收集細胞、洗滌、70％乙醇固定、PI(姬姆薩)染色、鏡檢，上流式細胞儀分析。結果表明，用倒置相差顯微鏡、普通光學顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡觀察，均能觀察到凋亡細胞的特征，給藥組與對照組有很大的區(qū)別。結果說明火菇素重組蛋白能夠促進U937腫瘤細胞的凋亡，和天然火菇素一樣有抗癌