人脂聯(lián)素基因的原核表達(dá)純化、抗體制備及應(yīng)用.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率不斷提高，研究表明血漿中脂聯(lián)素(ADPN)的含量與這類疾病的發(fā)生成負(fù)相關(guān)，因此檢測(cè)人血漿中脂聯(lián)素的含量可預(yù)知這類疾病的發(fā)生的可能性，可以盡早的為病人提供信息。目前檢測(cè)人血清中的脂聯(lián)素含量主要通過(guò)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，市面上的檢測(cè)試劑盒均為進(jìn)口，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。
　　 根據(jù)NCBI上公布的序列NM_004797.2，利用primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物。提取

2、人脂肪組織總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得732bp的人脂聯(lián)素全基因目的基因片段。將目的片段克隆入載體pET-CKS并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli TOP10F’，進(jìn)行PCR鑒定，堿裂解法提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì)，閱讀框正確的重組質(zhì)粒命名為pET-CKS/ADPN。
　　 重組質(zhì)粒pET-CKS/ADPN轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E. coli BL21-gold中，在化學(xué)劑-異丙基

3、硫代-β-D-半乳酸糖苷(IPTG)的作用自下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)，Western blot檢測(cè)融合蛋白與兔抗人脂聯(lián)素抗體反應(yīng)，證明其具有免疫反應(yīng)性。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確立了最佳的誘導(dǎo)條件為：30℃，0.1mM IPTG濃度，誘導(dǎo)表達(dá)8h。因融合蛋白氨基端含有6個(gè)組氨酸(His-tag)，可以用鎳金屬親和層析純化目的蛋白，將純化得到的融合蛋白溶液進(jìn)行透析復(fù)性，檢測(cè)其濃度較高，可進(jìn)行動(dòng)物免

4、疫。
　　 將復(fù)性的重組蛋白免疫家兔，間接ELISA檢測(cè)兔抗血清效價(jià)，在第六次免疫后，效價(jià)達(dá)到5×104左右，雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兔抗血清效價(jià)，當(dāng)其效價(jià)達(dá)到1:64后，殺兔取血，硫酸銨沉淀法和陰離子交換層析法純化兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體，測(cè)定其濃度為2.3mg/mL。
　　 將抗人脂聯(lián)素單克隆抗體作為固相抗體，采用改良的碘酸鈉法，對(duì)人脂聯(lián)素多克隆抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，作為標(biāo)記抗體，初步建立人脂聯(lián)素雙抗體夾心ELISA

5、檢測(cè)模式。棋盤滴定法確立人脂聯(lián)素單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1:1000,酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：1500。以重組脂聯(lián)素蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為2ng-10ng。臨床測(cè)定111份Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為6.5±0.33ng/mL，89份非Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為9.9±1.08ng/mL。
　　 本文通過(guò)基因工程方法得到了有免疫活性的重組人脂聯(lián)素蛋白，制備了兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體，初步建立的人脂聯(lián)素雙抗