日本七鰓鰻VLRB基因的克隆、原核表達(dá)及單克隆抗體制備的研究.pdf

1、七鰓鰻作為無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物的代表是脊椎動(dòng)物的祖先,從進(jìn)化地位上看它是聯(lián)系無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的重要物種,它勢(shì)必在研究脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中起到十分重要的作用?？勺兞馨褪荏wVLR作為重要的免疫分子,它的發(fā)現(xiàn)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供了重要線索,說(shuō)明早在無(wú)頜類(lèi)生物體內(nèi),便存在著一種類(lèi)似于人類(lèi)Ig分子的免疫分子,它作為適應(yīng)性免疫中的主要免疫受體,能夠識(shí)別多種異源蛋白并起始免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了進(jìn)一步了解七鰓鰻免疫系統(tǒng)的特點(diǎn)及功能,本文將進(jìn)行VLRB基

2、因克隆、蛋白表達(dá)及單克隆抗體的制備,最終獲得了VLRB單克隆抗體,為進(jìn)一步研究七鰓鰻適應(yīng)性免疫系統(tǒng)做準(zhǔn)備。
　　 本文的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Genbank公布的序列,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(全長(zhǎng)引物和保守區(qū)引物),應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),從經(jīng)免疫刺激的七鰓鰻肝臟中擴(kuò)增出VLRB完整開(kāi)放閱讀框基因序列(

3、1036bp)和保守區(qū)片段序列(252bp),然后連接到pMD-18T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,最后雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆菌。測(cè)序結(jié)果表明日本七鰓鰻體內(nèi)的確存在著VLRB基因。通過(guò)各類(lèi)七鰓鰻和盲鰻VLR序列之間的比對(duì)分析,可以看出他們不僅具有一定的相似性,還具有一段穩(wěn)定的保守區(qū)。
　　 將克隆得到的VLRB基因連接到表達(dá)載體pET-32a中,經(jīng)測(cè)序鑒定得到陽(yáng)性克隆,然后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌BL12菌株中表達(dá),最后提取可溶

4、性蛋白并進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢測(cè)表明,VLRB基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)融合表達(dá),獲得具有一定生物學(xué)活性的蛋白。
　　 將得到的純化蛋白與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合免疫Balb／c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞,用PEG4000進(jìn)行細(xì)胞融合。用相應(yīng)抗原包被,進(jìn)行間接Elisa篩選得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆,直至單克隆細(xì)胞陽(yáng)性孔率為100％,挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存。經(jīng)小鼠腹水制備大