LY3磷酸酶基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的初步制備.pdf

1、目的：在擴(kuò)增、克隆人的LY3基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建相應(yīng)的重組原核表達(dá)載體，原核表達(dá)含LY3的融合蛋白，并以此為免疫原，應(yīng)用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備LY3單克隆抗體，為將來進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)LY3蛋白編碼基因的序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增LY3基因，通過限制性內(nèi)切酶酶切、連接等亞克隆技術(shù)，利用pET-28a(+)質(zhì)粒構(gòu)建含LY3基因的原核表達(dá)載體，酶切、測序等鑒定，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后加IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SD

2、S-PAGE分離表達(dá)的LY3蛋白，經(jīng)Ni<'2+>-NTA凝膠親和層析純化目的蛋白，用Western Blot方法檢測重組蛋白的表達(dá)。以SDS-PAGE分離得到的融合蛋白為抗原，免疫Balb/c小鼠，利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，并通過間接ELISA方法鑒定。 結(jié)果：成功構(gòu)建了含LY3基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-LY3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Western Blot檢測到LY3融合蛋白的表達(dá)。以