空腸彎曲菌cdtB和cdtC原核表達(dá)及其產(chǎn)物的單克隆抗體制備.pdf

1、空腸彎曲菌是引起世界各地急性胃腸炎的主要病原菌。感染的病人除了表現(xiàn)出急性、自限性腹瀉外，特定血清型的空腸彎曲菌能引起自身免疫疾病，如格林-巴利綜合癥(GBS)。空腸彎曲菌有許多致病因子如:黏附、侵襲和產(chǎn)毒素，細(xì)胞致死性腫脹毒素(Cytolethaldistendin toxin，CDT)是一種由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，空腸彎曲菌也能產(chǎn)生這種毒素。CDT由三個(gè)相鄰的cdtA、cdtB和cdtC編碼。CDT毒素具有細(xì)胞毒性，能夠損傷

2、真核細(xì)胞的DNA，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，最終使受損傷的細(xì)胞腫脹死亡。目前，對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞致死性腫脹毒素功能機(jī)理等研究還不夠深入。本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)cdtB、cdtC基因，純化His-CdtB、His-CdtC、GST-CdtC蛋白，以His-CdtB蛋白為基礎(chǔ)，建立檢測空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法;同時(shí)以GST-CdtB的包涵體和GST-CdtC蛋白為免疫原;His-CdtB，His-CdtC蛋白為檢測原，利用

3、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備CdtB和CdtC的單克隆抗體，為CDT毒素功能、診斷技術(shù)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　一、空腸彎曲菌細(xì)胞致死性腫脹毒素cdtB、cdtC的原核表達(dá)
　　根據(jù)GenBank上公布的空腸彎曲菌NCTC11168的cdtB和cdtC基因序列設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增不含信號(hào)序列的2個(gè)基因，并與pMD-18T載體連接，酶切、測序鑒定正確后，將cdtB基因連接到表達(dá)載體pET(30a)和pGEX-6p-1，獲得重組菌BL2

4、1(pET-cdtB)和BL21(pGEX-6p-1-cdtB);將cdtC基因連接到表達(dá)載體pET(32a)和pGEX-6p-1，獲得重組菌BL21(pET-cdtC)和BL21(pGEX-6p-1-cdtC)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白與預(yù)期大小一致，His-CdtB、GST-CdtB大小為分別為29KD、53KD;His-CdtC、GST-CdtC大小分別為36KD

5、、47KD。利用蛋白質(zhì)的變復(fù)性獲得純化的蛋白His-CdtB和GST-CdtC，利用親和層析柱純化獲得His-CdtC。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　二、基于CdtB蛋白檢測空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及初步應(yīng)用
　　以純化的His-CdtB作為包被原，用NCTC11168攻毒獲得的血清作為陽性血清，建立了檢測空腸彎曲菌CdtB抗體的間接ELISA方法，以方陣實(shí)驗(yàn)對(duì)ELIS

6、A條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了ELISA反應(yīng)條件:抗原包被濃度為16μg/mL;封閉液為10％的馬血清;封閉時(shí)間為37℃，2h;最佳血清稀釋液為PBS;血清稀釋倍數(shù)為1∶200;一抗作用時(shí)間為2h;二抗作用濃度為1∶10000，作用時(shí)間為1h;顯色時(shí)間為4min。應(yīng)用優(yōu)化的ELISA方法對(duì)60份雞的血清樣品進(jìn)行測定，并采集相對(duì)應(yīng)的雞肛拭樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果顯示分離到20份空腸彎曲菌，對(duì)分離株進(jìn)行cdtB基因檢測，18份呈陽性;ELISA

7、檢測有14份為陽性，2種實(shí)驗(yàn)方法的符合率為78％;應(yīng)用建立的方法對(duì)388份人的血清樣品進(jìn)行測定，34份呈陽性，陽性率為8.76％。該檢測方法的建立對(duì)空腸彎曲菌的血清流行病學(xué)研究等提供了新方法。
　　三、CdtB和CdtC單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用
　　以原核表達(dá)的GST-CdtB和GST-CdtC蛋白為免疫原，以His-CdtB、His-CdtC分別為檢測原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。獲得5株穩(wěn)定分泌CdtB抗體

8、的細(xì)胞株，分別命名為1F3、1F5、2E4、2E11、2F2，2E11，單抗亞類為IgG2b，其它4株均為IgG1，腹水效價(jià)分別為1∶3276800、1∶6553600、1∶819200、1∶6553600、1∶13107200;獲得5株穩(wěn)定分泌CdtC抗體的細(xì)胞株，分別命名為3A10、4D2、2E1、6FA、3G5，單抗亞類均為IgG1;腹水效價(jià)分別為1∶6553600、1∶3276800、1∶1638400、1∶13107200、1

9、∶1638400。Western-blot分析顯示，每株單抗都能與相對(duì)應(yīng)的融合蛋白發(fā)生發(fā)應(yīng)，并出現(xiàn)特異性的條帶，說明單抗具有良好的特異性。
　　選擇Caco-2和HD-11細(xì)胞為模型，將2種抗體與NCTC11168中和1h后進(jìn)行黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，對(duì)于HD-11細(xì)胞，與2種抗體作用后的細(xì)菌的黏附和侵襲能力相對(duì)于對(duì)照組明顯下降，加入CdtB抗體黏附率和侵襲率分別下降了28％、11％;加入CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了27

10、％、32％;同時(shí)加入CdtB和CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了30％、47％;侵染HD-11細(xì)胞后的形態(tài)觀察和細(xì)胞數(shù)目測定顯示，只加入NCTC11168細(xì)菌的對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)為6.8×15個(gè)/mL;加入CdtB抗體后，活細(xì)胞數(shù)為1.4×106個(gè)/mL;加入CdtB和CdtC抗體后，活細(xì)胞數(shù)為2.6×106個(gè)/mL，加入抗體后的細(xì)胞存活率高于對(duì)照組。對(duì)照組的細(xì)胞明顯腫脹，而加入抗體后的細(xì)胞腫脹數(shù)明顯減少。對(duì)于Caco-2細(xì)胞，加入Cd