SY1磷酸酶基因的原核表達及其單克隆抗體的初步制備.pdf

1、目的：利用含有人的SY1的pBluescriptR質(zhì)粒，構建重組體，并用重組體轉染原核細胞表達含SY1的融合蛋白，以此融合蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，制備單克隆抗體，為將來進一步研究該基因的功能打好基礎。 方法：用PCR擴增SY1的cds序列，限制性內(nèi)切酶酶切，構建到pET28a(+)中，酶切、測序等鑒定后，重組體轉化大腸桿菌，IPTG誘導重組蛋白表達，在變性條件下經(jīng)Ni2+-NTA凝膠親和層析純化目的蛋白。WesternB

2、lot方法檢測重組蛋白的表達，用純化的SY1蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞，采用常規(guī)雜交瘤技術方法制備雜交瘤細胞，克隆化篩選陽性細胞克隆，制備單克隆抗體。間接ELISA試驗鑒定單克隆抗體并檢測單克隆抗體的效價。 結果：成功構建出pET28a(+)-SY1重組質(zhì)粒，SDS-PAGE顯示SY1融合蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在，WesternBlot方法檢測到融合蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)有相對分子量為41KD的特異