Flt-1胞外Ⅲ區(qū)基因克隆、表達(dá)研究及其單克隆抗體的制備.pdf

1、腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床治療腫瘤失敗的主要原因之一，因此，圍繞阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的研究已成為腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)之一。近幾十年來，大量研究結(jié)果已證實(shí)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤的血管新生(angiogenesis)，這一發(fā)現(xiàn)極大的促進(jìn)了該領(lǐng)域的研究開展。隨著血管新生相關(guān)機(jī)制研究的深入，越來越多基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)了通過抑制腫瘤血管新生來抑制腫瘤生長的理念。 血管新生是一個復(fù)雜的多步驟調(diào)控的過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖、遷

2、移和重塑，與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的血管新生中起重要作用。血管內(nèi)皮生長因子受體Ⅰ(fms—liketyrosinekinase，F(xiàn)lt—1)是VEGF受體之一，不僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞，胎盤滋養(yǎng)層，單核巨噬細(xì)胞，而且在許多實(shí)體瘤及血液腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)。目前研究認(rèn)為，F(xiàn)lt—1在

3、不同的生理或病理?xiàng)l件下的血管生成過程中具有雙重作用，在胚胎期能夠負(fù)性調(diào)節(jié)血管生成，但在成人期病理情況下Flt—1與VEGF結(jié)合后，則能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，使血管內(nèi)的蛋白外滲，形成內(nèi)皮細(xì)胞遷移的支架和臨時基質(zhì)，并引發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化，還能通過與PIGF結(jié)合來刺激干細(xì)胞的募集和活性，從而促進(jìn)血管新生。因此阻斷與Flt—1有關(guān)的信號傳導(dǎo)有著潛在的抑制腫瘤血管新生的作用。 Flt—1屬酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亞型，其結(jié)構(gòu)分為胞外

4、區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個部分，在其胞外區(qū)的7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域中，氨基端的Ⅰ—Ⅲ區(qū)是Flt—1的配體結(jié)合域所在區(qū)。本文的主要目的是表達(dá)Flt—1胞外Ⅲ區(qū)蛋白并檢測其生物活性，制備抗Flt—1胞外Ⅲ區(qū)的單克隆抗體，探討其生物活性，為以后制備基因工程抗體作好準(zhǔn)備工作。通過從人胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA，利用RT-PCR和PCR方法克隆Flt—1胞外Ⅲ區(qū)的基因，通過與表達(dá)載體pAYZ(含有堿性磷酸酶(phoA)啟動子和引導(dǎo)肽stll)進(jìn)行

5、相同的酶切消化，構(gòu)建成Flt—1胞外Ⅲ區(qū)的表達(dá)載體pAYZFlt—1，并在大腸桿菌16c9中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在于細(xì)胞周質(zhì)腔中，SDS-PAGE和Westernblot分析顯示，其分子量約為15kD，經(jīng)E-Tag親和層析柱純化，純化產(chǎn)物經(jīng)ELISA、單層細(xì)胞劃痕損傷、Transwell體外實(shí)驗(yàn)檢測表明具有結(jié)合VEGF以及抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移的活性。 純化目的蛋白免疫Balb/c小鼠，采用傳統(tǒng)B淋巴細(xì)