雞IL-17cDNA的克隆與表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、Interleukin-17(IL-17)是由效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的一種前炎性細(xì)胞因子。IL-17與多種細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)，如刺激破骨細(xì)胞生成、粒細(xì)胞生成、在適當(dāng)濃度的植物凝集素刺激下的T細(xì)胞增殖。目前對(duì)哺乳動(dòng)物IL-17的免疫學(xué)功能研究相對(duì)成熟，而對(duì)家禽的IL-17研究相對(duì)較少。
　　 為探討雞IL-17(ChIL-17)的免疫學(xué)性質(zhì)，本研究構(gòu)建了原核表達(dá)雞IL-17基因的重組大腸桿菌，獲得相應(yīng)的融合蛋白，并制備其特異性單克隆抗體。針對(duì)C

2、hIL17的特異性單克隆抗體(McAb)可用于建立簡(jiǎn)單、快速、敏感性高的ChIL-17檢測(cè)方法，同時(shí)為IL-17在禽類(lèi)免疫系統(tǒng)中的免疫生物學(xué)研究提供有用的工具。
　　 1.ChIL-17基因的克隆、序列分析與原核表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank上公布的ChIL-17基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，以ConA刺激的SPF雞脾臟淋巴細(xì)胞總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增ChIL-17基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到pMD18-T載體上經(jīng)

3、測(cè)序鑒定后，分別將目的基因插入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1和pET30(a)中，構(gòu)建出重組菌BL21(pGEX-6P-1-ChIL17)和BL21(DE3)(pET-ChIL17)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)的融合蛋白His-ChIL17、GST-ChIL17與預(yù)期大小一致，兩種融合蛋白均主要以包涵體形式存在。Western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白具有良好的免疫生物學(xué)活性。
　　 本研究還擴(kuò)

4、增了麻鴨、青腳雞、AA肉雞、安卡雞、雪山草雞、狼山雞、石岐雜雞、龍溪麻雞、青殼雞、三黃雞、烏骨雞、仙居雞、隱性白羽雞等13個(gè)品種雞和鴨的IL-17基因，其中SPF雞與隱性白羽、AA肉雞、三黃雞、青腳麻雞IL-17基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列完全一致；龍溪麻雞、石岐雜雞、雪山草雞IL-17基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列完全一致。分析了它們之間的核苷酸和氨基酸的進(jìn)化距離，結(jié)果表明各品系雞IL-17基因核苷酸同源性在98％-100％

5、之間，氨基酸同源性在95％-100％之間。SPF雞IL-17與其他品系雞的IL-17序列有0-8個(gè)核苷酸的差異，而氨基酸之間的差異最多只有3個(gè)。以上結(jié)果可以看出IL-17基因在不同種之間有著較高的種屬特異性，但在同種不同屬之間卻高度保守，甚至在同屬家禽的雞鴨之間也相對(duì)保守。
　　 2.雞IL-17單克隆抗體的制備與鑒定
　　 本研究以純化的原核表達(dá)融合蛋白GST-ChIL17作為免疫原，并以純化的融合蛋白His-ChIL

6、17為篩選抗原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出2株穩(wěn)定分泌抗Ch-IL17McAb的細(xì)胞株，命名為3E6、3E9。McAb免疫球蛋白亞類(lèi)鑒定均為IgG1，3E6腹水效價(jià)為102，400，Western blotting分析顯示，3E6單抗能特異性結(jié)合26 kDa的His-ChIL17和46 kDa的GST-ChIL17，Dot-ELISA試驗(yàn)表明，單抗3E6只與融合蛋白His-ChIL17和GST-ChIL17反應(yīng)，而不與空載體蛋白反應(yīng)