抗雞IgM單克隆抗體的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、近年來(lái)國(guó)內(nèi)大型集合化養(yǎng)雞場(chǎng)不斷涌現(xiàn)，養(yǎng)雞業(yè)成為國(guó)民的一大收入來(lái)源渠道，而疾病則是養(yǎng)雞業(yè)的最大威脅，其中又以傳染病危害最大，約占雞病總數(shù)的75％以上，尤其是禽流感之類急性的高度的致死的性傳染病一旦爆發(fā)，將會(huì)造成非常巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至還會(huì)危及到人類健康，對(duì)人類造成嚴(yán)重威脅。 目前，雞傳染病確切診斷依賴于病毒的分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)診斷技術(shù)以及電鏡技術(shù)等。(1)傳統(tǒng)的病毒分離鑒定：即病料通過(guò)細(xì)胞或雞胚培養(yǎng)分離病毒，經(jīng)理化

2、特性和電鏡進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行致病力測(cè)定，確定毒力強(qiáng)弱。(2)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：包括瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(AGP)；血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HA-HI)；神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NITT)；中和試驗(yàn)(NT)；免疫熒光技術(shù)(IFT)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等；(3)分子生物學(xué)技術(shù)包括：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)；核酸探針技術(shù)；以及熒光PCR法，熒光PCR法是目前最快速的檢測(cè)方法，能在4小時(shí)內(nèi)快速檢測(cè)。但是上述的檢測(cè)方

3、法有的耗時(shí)、費(fèi)力、診斷周期長(zhǎng)；有的需要大量的實(shí)驗(yàn)室工作，而且儀器設(shè)備昂貴，且不能對(duì)疫病作出早期診斷，迫切需要建立一種快速、敏感并且能通過(guò)同一套試劑對(duì)多種雞傳染病作出早期檢出的診斷方法，達(dá)到及時(shí)控制疫情、減少損失的目的。本研究利用制備的抗雞IgM單克隆抗體作為一種通用試劑初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)疫苗免疫情況的監(jiān)測(cè)，對(duì)雞傳染病的早期診斷研究具有重要意義。 本研究以純化的雞IgM制成油乳劑免疫抗原免疫BALB/c小鼠，取抗體效價(jià)較高的小鼠脾細(xì)胞與

4、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用PEG-1500進(jìn)行細(xì)胞融合，融合率為76.25％；建立間接ELISA方法，用于檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清中的單克隆抗體(McAb)，初檢陽(yáng)性率為16.39％；進(jìn)行多次亞克隆及反復(fù)篩選，獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗雞IgMMcAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1F7。1F7雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過(guò)反復(fù)凍存、復(fù)蘇及多次傳代，均能分泌較高效價(jià)抗體，其抗體效價(jià)保持在1∶1000以上；將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)7天后收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨法提純后間接

5、ELISA檢測(cè)其效價(jià)達(dá)1∶32000以上。單抗生物學(xué)初步鑒定結(jié)果顯示，制得的McAb具有親和力高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。乳膠凝集試驗(yàn)證實(shí)所分泌抗體均屬IgG1、κ型。本試驗(yàn)獲得的McAb將在雞傳染病的早期檢測(cè)及預(yù)報(bào)中發(fā)揮重要作用。 用H5亞型禽流感油乳劑疫苗對(duì)5-10周齡的雞進(jìn)行免疫，在免疫后3-10天多次采血并收集血清，采用間接ELISA法檢測(cè)血清中IgM抗體效價(jià)，具體操作步驟：1、以禽流感病毒(AIV)按最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，2

6、、加入待檢血清與之作用，3、按最佳工作濃度加入已獲得的純化抗雞IgMMcAb，4、加入工作濃度的羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體。由此獲得雞在免疫禽流感疫苗后開(kāi)始產(chǎn)生抗AIV的IgM抗體及抗AIV的IgM抗體效價(jià)達(dá)到最高的時(shí)間，并初步確定疫苗的免疫效果。 結(jié)論：本研究成功制備了抗雞IgM的多克隆抗體及McAb，并建立了間接ELISA法，將制備的抗雞IgMMcAb應(yīng)用在疫苗免疫情況的判定上，為雞傳染病的研究提供了一種新的通用試劑，且該法具有檢