抗人神經(jīng)菌毛素1b1b2區(qū)單克隆抗體的制備及其單鏈抗體原核表達(dá)菌的制備.pdf

1、神經(jīng)菌毛素-1（Neuropilin-1;NRP1）是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，可結(jié)合Ⅲ類神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子(SEMA3)介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，同時(shí)，通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合調(diào)節(jié)血管的生成，尤其是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。NRP1由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成，目前發(fā)現(xiàn)其胞外區(qū)的功能更為重要，胞外區(qū)分為a1a2、b1b2、c結(jié)構(gòu)域，VEGF165主要通過(guò)與NRP1胞外區(qū)b1b2結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮作用。因此，本課題組通過(guò)

2、基因工程技術(shù)克隆得到人NRP1 b1b2(HuNRP1b1b2)結(jié)構(gòu)域cDNA并表達(dá)其重組蛋白，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得特異性針對(duì)HuNRP-1b1b2單克隆抗體(M cAbs)并初步分析其生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)其可以與天然NRP1結(jié)合并且能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管。選擇有生物學(xué)活性的雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)基因工程技術(shù)提取mAb的重鏈及輕鏈編碼基因，構(gòu)建含抗人神經(jīng)菌毛素單鏈抗體（single chain Fragment varia

3、ble，ScFv）編碼基因的重組載體并進(jìn)行原核表達(dá)。
　　目的:構(gòu)建抗HuNRP1 b1b2單克隆抗體并研究其生物學(xué)活性，制備單鏈抗體原核表達(dá)菌，為進(jìn)一步研究HuNRP1b1b2生物學(xué)的功能提供生物材料。
　　方法:①克隆HuNRP1b1b2區(qū)的編碼基因并對(duì)其進(jìn)行蛋白表達(dá);②制備抗HuN RP-1b1b2的mAb并分析其生物學(xué)特性;③提取陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法獲取抗HuNRP1b1b

4、2重鏈可變區(qū)（Heavy Variable，VH）及輕鏈可變區(qū)(LightVariable，VL)的基因序列;④用重疊PCR(overlap-PCR)方法獲取抗HuNRP1b1b2 ScFV序列;⑤通過(guò)雙酶切及定向克隆技術(shù)把ScFV克隆到噬菌粒pCANTAB5E載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB5E-ScFV;⑥將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1菌。
　　結(jié)果:①獲得人神經(jīng)菌毛素1的b1b2區(qū)蛋白，大小約34 kDa。②獲得穩(wěn)定分泌抗

5、HuNRP1 b1b2 McAbs細(xì)胞株，命名為6A2與1A10。③單克隆抗體能夠識(shí)別天然NRP1，可有效抑制HUVEC的遷移并對(duì)HUVEC的體外成管能力具有一定的抑制作用。④通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)，初步獲得HuNRP1 b1b2單鏈抗體。
　　結(jié)論:獲得HuNRP1 b1b2單克隆抗體，且單克隆抗體具有與天然NRP1的結(jié)合能力，并且能夠抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管。通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)，初步獲得HuNRP1 b1b2單鏈抗體，