人巨噬細胞移動抑制因子的原核表達及其單克隆抗體的制備.pdf

1、人巨噬細胞移動抑制因子(hMIF)是一種重要的免疫調(diào)控細胞因子，組成性表達于全身多種組織，其主要來源是垂體前葉細胞、活化的T淋巴細胞、單核巨噬細胞等。hMIF基因編碼區(qū)含353bp，編碼由¨5個氨基酸殘基組成、分子量約為12.5kD的非糖基化蛋白。除細胞因子的基本功能外，hMIF還具有類似激素、生長因子、應激反應蛋白及糖基化抑制因子(glycosylatedinhibitoryfactors,GIF)等的多重作用，并可調(diào)節(jié)機體的免疫應答

2、。近年來研究發(fā)現(xiàn)和證實，hMIF可促進感染性休克、風濕性關節(jié)炎等感染性、自體免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，hMIF還可加速創(chuàng)傷后的組織修復。故本文hMIF的原核表達和抗hMIF單克隆抗體的制備研究將為上述疾病的診斷和治療提供新的機遇。 主要的研究內(nèi)容和結果：1.hMIF基因的克隆和原核表達 (1)根據(jù)GenBank發(fā)表的hMIFcDNA序列設計了一對特異引物，經(jīng)RT-PCR從人乳腺癌細胞株MDA-MB453和人乳腺

3、癌組織擴增hMIFcDNA，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)擴增出全長為353bp的hMIF基因片段；凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并將其構建到原核表達載體pET11b中，測序表明所克隆到的hMIF序列與GenBank發(fā)表的hMIFcDNA序列完全一致。 (2)重組質(zhì)粒pET11b/hMIF轉化大腸桿菌BL21(DE3)，按IPTG的作用時間分組誘導hMIF蛋白的表達；TricineSDS-PAGE可見，與未誘導組相比，IPTG誘導組細菌有一條

4、分子量約為12.5kD的特異蛋白條帶，與hMIF蛋白的預計分子量相符；誘導6h時蛋白表達量最高，約占細菌總蛋白的30％。將表達菌破菌離心后分別取細菌上清和沉淀電泳，證實該蛋白為可溶性表達。 (3)將BL21重組菌(pET11b/hMIF)誘導發(fā)酵，超聲破菌；1g濕菌經(jīng)陽離子交換和疏水層析可得到約53mg純度為95.40％的hMIF，得率約為17.7％，純化的蛋白濃度為1.145g/L，Westernblotting結果表明純化的

5、hMIF蛋白能與鼠抗hMIF單克隆抗體形成特異性條帶。 2.抗hMIF單克隆抗體的制備 (1)用純化的hMIF蛋白免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術經(jīng)5次細胞融合，利用間接ELISA法和克隆化篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗hMIF單克隆抗體的雜交瘤細胞株hMIF-A2、hMIF-D5，其細胞培養(yǎng)上清的效價分別達1：3200和1：6400。 (2)2株雜交瘤細胞核型分析發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目在80～102之間，同時含有端著絲粒