鴨MHCⅡα、β鏈的克隆和原核表達(dá)及其抗體制備.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的編碼免疫球蛋白樣受體(immunoglobulin-likereceptors)的基因群，與機(jī)體抗病力和免疫應(yīng)答相關(guān)。MHC據(jù)結(jié)構(gòu)與功能可分為MHCI，MHCII和MHCIII等三類，MHCII分子呈現(xiàn)在免疫系統(tǒng)特定的細(xì)胞表面，由α鏈和β鏈非共價(jià)鍵組成的一組高度多態(tài)性的跨膜糖蛋白。其中MHCII類分子只表達(dá)在有限種類的細(xì)胞表面，

2、如包括B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的專職性抗原遞呈細(xì)胞(APC)以及胸腺上皮細(xì)胞和激活的T淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起重要作用。MHCII類分子主要是在免疫應(yīng)答的始動(dòng)階段將經(jīng)過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細(xì)胞。MHCII類分子表達(dá)與否及其表達(dá)水平，直接決定免疫應(yīng)答的發(fā)生及其強(qiáng)度，其表達(dá)水平的改變還參與某些自身免疫病、腫瘤、免疫缺陷等疾病過程的發(fā)生和發(fā)展，因此它在免疫學(xué)上具有重要的研究?jī)r(jià)值。為了探索鴨MHCII類分子在免疫

3、應(yīng)答中的作用及其機(jī)理，本研究對(duì)其進(jìn)行了克隆、表達(dá)及制備了多克隆抗體。 首先，據(jù)NCBI上已發(fā)表的鴨類MHCII的α鏈和β鏈基因序列與載體的多克隆酶切位點(diǎn)自行設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過RT-PCR從北京鴨脾臟的總RNA中得到MHCIIα和MHCIIβ基因，將其克隆至pMD18-T上，經(jīng)酶切分析及序列測(cè)定后，進(jìn)一步亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-KG上。結(jié)果表明：本研究成功克隆了北京鴨MHCIIα和MHCIIβ鏈基因。MHCI

4、Iα大小為633bp，經(jīng)測(cè)序與已登錄的基因序列同源性為99％，只有5個(gè)核苷酸的差異，導(dǎo)致2個(gè)氨基酸的改變；MHCIIβ大小為798bp，經(jīng)測(cè)序與已登錄的基因序列同源性為92％，有61個(gè)核苷酸的差異，導(dǎo)致39個(gè)氨基酸發(fā)生改變。 其次，將上述構(gòu)建成功的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-α和pGEX-KG-β，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-b-D-galactoside，I

5、PTG)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了融合蛋白MHCIIα和MHCIIβ；對(duì)表達(dá)條件誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、起始OD600值、通氣量、培養(yǎng)基pH及抗生素(Kan和Amp)濃度等進(jìn)行了優(yōu)化，得出MHCIIα融合蛋白在誘導(dǎo)溫度為22℃，誘導(dǎo)3h，IPTG濃度為0.05mmol/L，起始誘導(dǎo)OD600值為0.45，通氣量70％，pH7.2，Kna50μg/ml時(shí)的表達(dá)量最高，而MHCIIβ融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件是在37℃，誘導(dǎo)3h，IPTG濃度為0.5

6、0mmol/L，起始誘導(dǎo)OD600值為0.45，通氣量70％，pH5.7，Amp50μg/ml，表達(dá)的融合蛋白均以包涵體形式存在。采用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法純化了MHCIIα和MHCIIβ包涵體，經(jīng)過變性和復(fù)性，溶解的包涵體通過親和層析獲得了純度為90％以上的融合蛋白。 最后，利用純化的MHCIIα和MHCIIβ融合蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)與免疫印跡法(Westernblot)表明，制