綿羊肺腺瘤病毒受體hyal-2的原核表達及其多克隆抗體制備.pdf

1、目的:克隆綿羊肺腺瘤病毒受體hyal-2基因全長，將其重組入原核表達載體中，構建重組質(zhì)粒，進而轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中，進行誘導表達，利用親和層析的方法純化出Hyal-2蛋白，制備hyal-2的多克隆抗體，為進一步鑒定JSRV感染的組織細胞，探究JSRV的組織嗜性奠定基礎。
　　方法:本研究根據(jù)已報道的hyal-2基因序列，經(jīng)primer5.0軟件設計一對特異性的引物序列，利用PCR方法擴增hyal-2基因序列，并將其重

2、組入pGEX-4T-1原核表達載體中，構建pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒，進行菌液PCR及測序，鑒定重組質(zhì)粒構建的正確性。將其轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導后進行10％ SDS-PAGE電泳分析，檢測融合蛋白的表達情況，經(jīng)Westernblotting驗證融合蛋白的表達。為了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、穩(wěn)定、高效地表達，本試驗分別對重組菌表達GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG誘導濃度、誘導時間、

3、溫度進行了優(yōu)化，摸索最佳的表達條件。進而利用谷胱甘肽親和層析的方法對目的蛋白進行親和純化，將純化后的目的蛋白免疫家兔，制備Hyal-2蛋白的多克隆抗體，經(jīng)雙向瓊脂擴散實驗測定多克隆抗體的效價，經(jīng)Western blotting檢測多克隆抗體的特異性。
　　結果:利用PCR方法成功擴增出了hyal-2基因片段，大小為1431 bp，測序結果顯示hyal-2基因正確的插入到表達載體中，成功構建了pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒

4、。重組菌經(jīng)IPTG誘導表達了相應預期大小的Hyal-2融合蛋白，蛋白大小為80 ku，Western blotting也進一步驗證了融合蛋白的表達。利用谷胱甘肽親和層析的方法，純化出了目的蛋白，利用Bradford法測得蛋白濃度為636.1μg/mL，與佐劑充分乳化后，免疫家兔，制備出了兔抗Hyal-2蛋白的多克隆抗體。雙向瓊脂擴散實驗結果顯示，多克隆抗體的效價達到了1∶16，經(jīng)Western blotting分析表明制備的多克隆抗體能