綿羊肺腺瘤病毒受體hyal-2的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備.pdf

1、目的:克隆綿羊肺腺瘤病毒受體hyal-2基因全長(zhǎng)，將其重組入原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)而轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用親和層析的方法純化出Hyal-2蛋白，制備hyal-2的多克隆抗體，為進(jìn)一步鑒定JSRV感染的組織細(xì)胞，探究JSRV的組織嗜性奠定基礎(chǔ)。
　　方法:本研究根據(jù)已報(bào)道的hyal-2基因序列，經(jīng)primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物序列，利用PCR方法擴(kuò)增hyal-2基因序列，并將其重

2、組入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，構(gòu)建pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒，進(jìn)行菌液PCR及測(cè)序，鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行10％ SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，經(jīng)Westernblotting驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)。為了使GST-Hyal-2融合蛋白大量、穩(wěn)定、高效地表達(dá)，本試驗(yàn)分別對(duì)重組菌表達(dá)GST-Hyal-2融合蛋白的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、

3、溫度進(jìn)行了優(yōu)化，摸索最佳的表達(dá)條件。進(jìn)而利用谷胱甘肽親和層析的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，將純化后的目的蛋白免疫家兔，制備Hyal-2蛋白的多克隆抗體，經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)，經(jīng)Western blotting檢測(cè)多克隆抗體的特異性。
　　結(jié)果:利用PCR方法成功擴(kuò)增出了hyal-2基因片段，大小為1431 bp，測(cè)序結(jié)果顯示hyal-2基因正確的插入到表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-hyal-2重組質(zhì)粒

4、。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了相應(yīng)預(yù)期大小的Hyal-2融合蛋白，蛋白大小為80 ku，Western blotting也進(jìn)一步驗(yàn)證了融合蛋白的表達(dá)。利用谷胱甘肽親和層析的方法，純化出了目的蛋白，利用Bradford法測(cè)得蛋白濃度為636.1μg/mL，與佐劑充分乳化后，免疫家兔，制備出了兔抗Hyal-2蛋白的多克隆抗體。雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多克隆抗體的效價(jià)達(dá)到了1∶16，經(jīng)Western blotting分析表明制備的多克隆抗體能