LP-PLA2的原核表達(dá)、抗體制備及表位分析.pdf

1、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)屬于ⅦA型磷脂酶A2,它可以預(yù)測(cè)與冠脈事件有關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和中風(fēng)危險(xiǎn)。目前,在國(guó)內(nèi),LP-PLA2臨床診斷試劑主要依賴于從國(guó)外進(jìn)口,所需費(fèi)用昂貴,限制了該檢測(cè)項(xiàng)目在我國(guó)的推廣及應(yīng)用,因此,研發(fā)LP-PLA2體外免疫診斷試劑尤為重要。
　　 目的：本研究旨在獲取人脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2蛋白,制備相應(yīng)抗體,同時(shí)驗(yàn)證經(jīng)

2、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的表位肽的抗原性,為L(zhǎng)P-PLA2體外免疫診斷試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采用Trizol法從分化的THP-1細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增目的片段LP-PLA2;利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒;轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3),優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,進(jìn)行多步驟純化并除去標(biāo)簽,獲得目的蛋白,免疫新西蘭大白兔,制備抗LP-PLA2的多克隆抗體;運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法對(duì)LP-PLA2抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),并用純

3、化的LP-PLA2多克隆抗體鑒定其抗原性。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了PET-28a(+)-LP-PLA2,PGEX-4T-2-LP-PLA2,pColdTF-LP-PLA2等重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE電泳顯示:LP-PLA2在PET-28a(+)-LP-PLA2表達(dá)載體中不表達(dá);在PGEX-4T-2-LP-PLA2表達(dá)載體中少量表達(dá),且主要以包涵體形式存在;在pCo

4、ld TF-LP-PLA2表達(dá)載體中,獲得表達(dá)量較高的融合蛋白,主要以上清形式存在。
　　 3.將pCold TF-LP-PLA2誘導(dǎo)表達(dá)上清經(jīng)鎳柱親和層析純化后,獲得TF-LP-PLA2重組蛋白,將該重組蛋白用HRV-3C prolease酶切后,用藍(lán)膠分離純化,獲得了純度約為90％、分子量約為45kD的蛋白,與預(yù)期相符,且該蛋白能夠被市售的LP-PLA2多克隆抗體識(shí)別,證明獲得了純度較高的LP-PLA2目的蛋白。
　　

5、 4.制備了抗LP-PLA2的多克隆抗體,抗體效價(jià)＞1:5.12×106,Western blot結(jié)果表明,該抗體特異性較高。
　　 5.運(yùn)用生物信息學(xué)軟件綜合分析預(yù)測(cè)了LP-PLA2的三段表位肽,體外抗原抗體免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了三段表位肽均具有良好的抗原性。
　　 結(jié)論成功表達(dá)并純化獲得了高純度的LP-PLA2蛋白;制備了效價(jià)和純度均較高的LP-PLA2多克隆抗體;運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)了LP-PLA2的三段表位肽