人組織激肽釋放酶6原核表達載體的構(gòu)建及抗體制備.pdf

1、目的:
　　 人組織型激肽釋放酶基因家族(Kallikreins,KLKs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志家族,屬于絲氨酸蛋白酶家族,KLK6(Kallikrein6,KLK6)是該家族成員之一,編碼人組織型激肽釋放酶6(humanKallikrein6,hK6)。成熟的hK6蛋白含223個氨基酸,具有胰蛋白酶樣活性,與乳腺癌、卵巢癌、胃癌、腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。其研究目的在于構(gòu)建hK6原核表達載體并制備高效價、高特異度的多

2、克隆抗體和單克隆抗體,為建立檢測方法檢測組織和體液中hK6奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、提取人乳腺浸潤導管癌組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄為eDNA,根據(jù)GeneBank發(fā)表的核苷酸序列D78203,設(shè)計KLK6引物,擴增出KLK6基因片段,先克隆入pMD-19T克隆載體SacⅠ、XhoⅠ位點,經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定和基因測序后確定pMD-19T-KLK6的重組陽性菌,然后提取質(zhì)粒,膠回收純化KLK6目的片段,克隆入pE

3、T-28b原核表達載體的多克隆位點,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,篩選出陽性菌落后,IPTG誘導表達hK6融合蛋白,對誘導時間、溫度進行優(yōu)化并確定蛋白表達形式,擴大培養(yǎng),大量表達蛋白,進行鎳柱純化、SDS-PAGE及western-blot檢測。
　　 2、純化hK6融合蛋白與弗氏佐劑等體積混合,乳化均勻后,免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,每10天加強免疫一次,四次免疫后抗體效價達峰值,對新西蘭大白兔進行心臟采血,分離出血清,-80

4、℃冰箱保存?zhèn)溆?。BALB/c小鼠抗體效價達到105后,腹腔加強免疫一次,3天后取小鼠脾臟,制備脾細胞懸液,與預先培養(yǎng)并經(jīng)8-AG篩選的骨髓瘤細胞SP2/0融合,HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng),有限稀釋法篩選穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株,制備腹水獲得單克隆抗體。間接ELISA方法檢測抗體效價,純化抗體后檢測IgG亞型并進行western-blot檢測和免疫組化檢測,抗體純化后保存于-80℃冰箱備用。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建p

5、ET-28b-KLK6原核表達載體,28℃、1mMIPTG誘導8小時時蛋白表達達峰值,且以可溶性形式表達,其hK6融合蛋白分子量為25KD。
　　 2、鎳柱純化的hK6融合蛋白免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,得到的抗血清效價為107;細胞融合后經(jīng)有限稀釋法篩選出4株分泌抗體的雜交瘤細胞株(DB2C4、DB3D7、BD3G7、DD385),回輸小鼠腹腔,從腹水中提取單克隆抗體,效價均為51200;IgG亞型分析均為IgG1;w