人TREM-1原核表達載體構(gòu)建和多克隆抗體制備及急性肺部感染患者可溶性TREM-1檢測.pdf

1、[目的]
　　 TREM-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是一種在炎癥反應(yīng)的觸發(fā)及放大過程中具有重要作用的分子，選擇表達于髓樣細胞(如單核/巨噬細胞、中性粒細胞)表面，可放大促炎性細胞因子的釋放，因此它在感染性疾病，膿毒癥等發(fā)揮重要作用。感染早期TREM-1可以可溶性形式(soluble TREM-1，sTREM-1)釋放進入體液，而且sTREM

2、-1與感染嚴重程度有較好的相關(guān)性，提示sTREM-1是一種早期診斷急性肺部感染的新指標，為了進一步研究人TREM-1在急性肺部感染發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建TREM-1原核表達載體，表達、純化TREM-1蛋白；進一步制備多克隆抗體，并對多克隆抗體進行鑒定；建立sTREM-1 ELISE檢測方法，并檢測急性肺部感染患者血清的TREM-1含量。為急性肺部感染的早期診斷及療效評價、預(yù)后估計提供新的指標和方法。
　　 [方法]
　

3、　 1.構(gòu)建含人TREM-1胞外段目的基因的T載體克隆及原核表達載體亞克隆，經(jīng)酶切、PCR和測序證實后，用IPTG誘導表達TREM-1融合蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定，將重組基因工程菌擴大誘導表達，親和層析法純化誘導的TREM-1融合蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏完全佐劑乳化，將其作為抗原免疫家兔，獲得兔抗人免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，獲得初步純化的兔抗人TREM-1多克隆抗體，通過雙擴散試驗和間接ELISE方法檢測多

4、克隆抗體的效價和純度，Western bolt對它進行鑒定。
　　 3.用商品單抗和自制多抗建立ELISE夾心法，并對方法進行條件優(yōu)化，測定其準確度、精密度、重復(fù)性和線性范圍，方法建立后用于檢測急性肺部感染患者血清中可溶性TREM-1的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成功構(gòu)建了高表達重組人TREM-1蛋白的原核表達載體，并表達具有抗原性的TREM-1融合蛋白。
　　 2.獲得純化的TREM-1融合蛋白，

5、并用其免疫家兔，得到兔抗人TREM-1多克隆抗體。以重組蛋白為抗原，用間接ELISE檢測TREM-1抗血清的效價達到1:25600，雙向瓊脂免疫擴散試驗顯示TREM-1多克隆抗體與抗原之間形成單一沉淀線，效價達到1:16，Western bolt分析TREM-1抗血清在分子量21.80KDa處與相應(yīng)的原核表達蛋白呈現(xiàn)特異性條帶，表明所制備的多克隆抗體效價較高，具有良好的純度。
　　 3.建立可溶性TREM-1 ELISE檢測方法

6、，并對30例急性肺部感染和30例正常體檢血清標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)急性肺部感染患者TREM-1含量明顯增高。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了高效表達重組人TREM-1融合蛋白的原核表達載體，獲得高效穩(wěn)定的重組基因大腸桿菌表達菌株，經(jīng)IPTG誘導表達的TREM-1融合具有免疫原性，將其作為免疫原制備的兔抗人TREM-1多克隆抗體能與純化的外源性TREM-1融合蛋白和天然表達的內(nèi)源性TREM-1蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，檢測TREM-