髓樣細胞表達激發(fā)受體-1(TREM-1)在小鼠重癥急性胰腺炎中的表達及分子治療應(yīng)用.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種病因復(fù)雜，發(fā)病機制不明，臨床常見的急腹癥，其病情兇險，預(yù)后不良，治療棘手，并發(fā)癥多，目前病死率仍高達20-30％，有關(guān)其治療方法的探索一直是研究的熱點。
　　 目前臨床上已有通過檢測C反應(yīng)蛋白和降鈣素原等來判斷SAP炎預(yù)后，但是應(yīng)用價值非常有限。SAP的一個重要問題是尚沒有一個特異的血清學(xué)或者其他指標(biāo)來診斷和預(yù)測預(yù)后，進而指導(dǎo)治療。
　　

2、髓樣細胞表達的激發(fā)受體(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)屬免疫球蛋白超家族。TREM-1首次發(fā)現(xiàn)是在2001年，加深了人們對炎癥反應(yīng)啟動和發(fā)展過程的認識。其主要表達于中性粒細胞、成熟單核細胞和巨噬細胞等天然免疫反應(yīng)的效應(yīng)細胞，選擇性地表達于肺泡、腸液及其他體液的吞噬細胞上。TREM-1在眾多炎癥反應(yīng)參與的疾病(包括感染性和非感染性炎癥反應(yīng)、腫瘤等)中均有表達。TRE

3、M-1能促進小鼠促炎因子分泌，誘導(dǎo)中性粒細胞和單核細胞分泌中性粒細胞趨化因子，如IL-8、單核細胞趨化蛋白(MCP-1、MCP-3)及巨噬細胞炎癥反應(yīng)蛋白-1α(MIP-1α)。TREM-1的激活能導(dǎo)致中性粒細胞迅速脫顆粒、呼吸爆發(fā)及吞噬作用。Toll樣受體(TLR)-2或TLR-4與配體識別后可激活TREM-1，促進大量致炎細胞因子的釋放，同時抑制IL-10的釋放。TREM-1與這些下游細胞因子形成一個正反饋的自分泌調(diào)節(jié)回路，促使炎癥

4、反應(yīng)增強放大。同時，通過磷脂酰肌醇-3激酶依賴途徑，激活TLRs可促進TREM-1的表達。TLR可能通過激活NF-κB，來調(diào)節(jié)TREM-1的表達；而TREM-1同樣可以激活多種轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，協(xié)同NF-κB促進促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄。這些研究結(jié)論顯示，TREM-1和TLR共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大和膿毒癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用。Gibot等人分別構(gòu)建了小鼠膿毒癥模型和Wistar大鼠膿毒癥模型，分別合

5、成了類似小鼠和大鼠TREM-1胞外區(qū)部分合成肽段，在小鼠膿毒性休克模型里，小鼠胞外區(qū)合成肽可以保護內(nèi)毒素血癥小鼠免于死亡，而在大鼠模型中，利用合成大鼠胞外區(qū)肽段治療，發(fā)現(xiàn)可以改善血流動力學(xué)狀態(tài)，減輕乳酸酸中毒癥狀，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放，提高生存率。研究結(jié)果顯示，胞外區(qū)肽段可能成為膿毒癥治療的有效靶標(biāo)。
　　 本課題擬通過小鼠SAP模型，分析TREM-1mRNA水平的表達以及使用免疫組化的方法檢測TREM-1

6、蛋白水平的表達，評估其在SAP病程中的作用；構(gòu)建小鼠TREM-1-IgG融合蛋白的原核表達載體，在大腸桿菌中大量表達并純化出小鼠TREM-1融合蛋白，對其進行優(yōu)化，取得較高純度蛋白，用于治療小鼠SAP，驗證TREM-1作為SAP分子治療靶點的價值，從而為更深入了解TREM-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，為明確TREM-1能否作為各種疾病的診斷標(biāo)志和治療靶點提供依據(jù)，為探索相關(guān)疾病新的治療方法提供線索。
　　 一、TREM-1在小鼠SAP的表

7、達
　　 目的：檢測小鼠SAP胰腺組織TREM-1的表達
　　 方法：50只雄性昆明小鼠隨機分為5組，用生理鹽水配置20％L-精氨酸利用腹腔注射的方法，按照4g/kg的劑量，間隔一小時重復(fù)注射一次，制備SAP模型。對照組昆明小鼠，腹腔注射生理鹽水，造模后24h，48h，72h，96h分批處死小鼠，心臟采血，同時留取胰腺，肝臟，肺臟組織。測定淀粉酶，肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶，觀察各組小鼠胰腺等組織病理學(xué)變化并評分；并以RT-PCR

8、，real-timePCR的方法檢測外周血白細胞及胰腺組織TREM-1 mRNA表達；免疫組化法檢測小鼠胰腺組織中TREM-1蛋白表達。
　　 結(jié)果：血清淀粉酶檢測和組織病理學(xué)結(jié)果，證實造模成功。各組小鼠按照時間點處置，無菌操作下留取胰腺組織，抽提總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增出小鼠TREM-1，擴增產(chǎn)物與預(yù)期目的基因一致，回收純化產(chǎn)物送檢測序，測序結(jié)果與GenBank公布的序列同源性100％。進行rea

9、l-timePCR相對定量檢測，統(tǒng)計結(jié)果顯示TREM-1mRNA表達量隨著病程進展在各組小鼠胰腺組織中發(fā)生變化。免疫組化結(jié)果顯示TREM-1蛋白在SAP小鼠的胰腺組織存在表達。
　　 結(jié)論：TREM-1的相對表達量在SAP小鼠病程中逐漸升高，48h升至頂峰，后逐漸下降，提示TREM-1在SAP的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。
　　 二、TREM-1-IgG重組融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達、純化和鑒定
　　 目的：構(gòu)建

10、小鼠TREM-1-IgG重組融合蛋白的原核表達載體，大量表達融合蛋白，純化后進行鑒定。
　　 方法：利用限制性內(nèi)切酶位點EcoRⅠ，BamHⅠ和XhoⅠ，雙酶切表達載體pMD18-T；pMD18-T/小鼠TREM-1胞外區(qū)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切；pMD18-T/人IgG-Fc質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切；酶切后的三片段由T4DNA ligase連接，連接產(chǎn)物應(yīng)用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞

11、，抽提鑒定重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG。選擇自構(gòu)建載體pet-28a-His-sumo為表達載體，從pGEX4T-1/小鼠TREM-1-IgG質(zhì)粒上PCR擴增目的片段，BglⅡ/XhoⅠ雙酶切后的片段接入到pet28a-His-sumo，構(gòu)建表達重組蛋白的原核表達質(zhì)粒pet28a/小鼠TREM-1-IgG。經(jīng)測序鑒定無誤。陽性克隆轉(zhuǎn)入BL21以后，IPTG誘導(dǎo)表達蛋白，同時優(yōu)化表達條件，使用His-affinity-

12、resin層析柱純化；初步純化后的融合蛋白為小鼠TREM-1-IgG(含載體上SUMO蛋白)，應(yīng)用SUMO蛋白酶酶切去除SUMO。純化后的蛋白進行SDS-PAGE及Westem-Blot來鑒定表達產(chǎn)物。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG原核表達載體構(gòu)建后，經(jīng)轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α后質(zhì)粒進行雙酶切，RT-PCR擴增后行酶切，獲得原質(zhì)粒和目的基因的兩條特異性條帶，并經(jīng)測序鑒定。SDS-PAG及Wes

13、tern-Blot分析證實表達產(chǎn)物為TREM-1融合蛋白。更換載體進行蛋白優(yōu)化，使用SUMO蛋白酶將初步純化后的表達產(chǎn)物去除SUMO,獲得純化后TREM-1融合蛋白，行SDS-PAGE和Western Blot檢測，證實為目的蛋白。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了小鼠TREM-1重組融合蛋白的原核表達載體，對表達產(chǎn)物進行蛋白優(yōu)化過程，通過SAS-PAGE和Western-Blot檢測，證實為目的蛋白。
　　 三、TREM-1融合

14、蛋白對SAP小鼠的治療作用
　　 目的：觀察TREM-1融合蛋白對SAP小鼠的治療作用
　　 方法：70只昆明種小鼠，每只經(jīng)腹腔注射精氨酸構(gòu)建SAP模型后，隨機將其分為7組，一組和二組為TREM-1融合蛋白治療組，造模后6小時經(jīng)尾靜脈注射TREM-1融合蛋白，給藥濃度為8mg/kg，三組和四組為陽性對照組，七組為陰性對照組。采用目前臨床上治療SAP的藥物烏司他丁，給藥濃度為10萬U/kg，五組和六組為SAP對照組，以生理

15、鹽水靜脈注射。一、三、五組分別在造模后24h處死，二、四、六組分別在造模后72h處死。檢測外周血中炎癥因子的表達，病理分析胰腺和肺臟的損傷情況，評估TREM-1重組融合蛋白的治療作用。同時免疫組化半定量觀察療效。
　　 結(jié)果：TREM-1融合蛋白治療組可顯著提高生存率(P＜0.05)；病理學(xué)結(jié)果示TREM-1融合蛋白治療組較SAP對照組在胰腺及肺臟的水腫出血，炎癥，壞死明顯減輕(P＜0.05)；血清中炎癥因子(sTREM-1，M

16、IP-1α和超敏CRP)含量顯著低于SAP對照組(P＜0.05)；免疫組化結(jié)果證實TREM-1融合蛋白24h治療組的胰腺及肺臟組織中NF-κB陽性率及染色強度較SAP對照組顯著降低(P＜0.05)；與烏司他丁治療組療效相當(dāng)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：TREM-1重組融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕胰腺、肺臟組織損害，降低血清中炎性因子含量。
　　 通過上述研究，本課題得出以下結(jié)論：
　　 1、TR

17、EM-1參與了SAP發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)，外周血TREM-1含量在SAP小鼠病程中逐漸升高，48h升至頂峰，后逐漸下降。
　　 2、成功構(gòu)建了小鼠TREM-1融合蛋白的原核表達載體，大量表達并純化出小鼠TREM-1重組融合蛋白；并經(jīng)鑒定證實為目的蛋白。
　　 3、TREM-1融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕胰腺、肺臟組織損害，提高生存率，動物實驗初步證實TREM-1作為分子治療靶點可能是SAP治療的一個新

18、選擇。
　　 小結(jié)：本研究通過動物模型初步證實TREM-1在SAP小鼠中表達，同時構(gòu)建載體，表達并純化獲得小鼠TREM-1重組融合蛋白，觀察TREM-1重組融合蛋白對SAP小鼠的治療作用，通過ELISA方法檢測血清中TREM-1,CRP，IL-1β，MIP-1α等炎癥因子，以及組織病理變化來觀察療效，了解TREM-1與各種炎癥因子的相互作用，初步證實了TREM-1作為小鼠SAP分子治療靶點的價值。為SAP患者外周血sTREM-1