大鼠TREM-1-人IgG融合蛋白構(gòu)建表達與急性重癥胰腺炎分子治療.pdf

1、目的：構(gòu)建大鼠髓樣細(xì)胞表達激發(fā)受體—1/人IgG融合蛋白真核表達載體，在家蠶Bm細(xì)胞中實現(xiàn)穩(wěn)定表達，并且觀察融合蛋白TREM—1/IgG對急性重癥胰腺炎大鼠的療效。
　　 方法：分別設(shè)計引物PCR擴增大鼠TREM—1胞外區(qū)和人IgGFc段，產(chǎn)物酶切回收片段用T連接酶連接后PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆至pMD18—T質(zhì)粒中，并與轉(zhuǎn)座載體Bac1分別用BamHⅠ，HindⅢ雙酶切，回收兩端帶酶切位點的基因片段，用T連接酶連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)

2、座質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，接種于含氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，測序。將重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac中，涂于含X—ga1和IPTG的篩選平板(含慶大霉素、卡那霉素及四環(huán)素)上，37℃培養(yǎng)48h，挑取白色菌落以及藍色陰性對照菌落，提取重組桿粒，并用pUC/M13引物做PCR鑒定正確，并轉(zhuǎn)染Bm細(xì)胞，蛋白表達，Western—blot法行蛋白鑒定并純化蛋白。
　　

3、雄性SD大鼠40只，隨機分為融合蛋白治療1組、融合蛋白治療2組、生理鹽水組、對照組各10只。前三組采用精氨酸腹腔注射構(gòu)建急性重癥胰腺炎大鼠模型，造模成功后2小時，融合蛋白治療1組大鼠予以尾靜脈注射純化后的融合蛋白TREM—1/IgG，給藥濃度為4mg/kg，治療后24小時處死大鼠；融合蛋白治療2組大鼠于造模成功后12小時尾靜脈注射純化后的融合蛋白TREM—1/IgG，治療后24小時處死大鼠；生理鹽水組予以生理鹽水注射，治療后24小時處死

4、大鼠；對照組無處理。各組檢測血淀粉酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及C反應(yīng)蛋白水平，觀察各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化，并對組織損傷評分。
　　 結(jié)果：RT—PCR擴增出大鼠TREM—1胞外區(qū)和人IgG重鏈基因Fc恒定區(qū)，上述PCR產(chǎn)物連接擴增后與載體pMD—18 T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽提質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確，再與轉(zhuǎn)座載體Bac1連接，轉(zhuǎn)染后獲得重組質(zhì)粒。測序結(jié)果證實序列、啟動子、終止子位置及讀碼框完全正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)

5、大腸桿菌DH10Bac中，獲得重組桿粒，用pUC/M13引物做PCR鑒定正確。重組桿粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bm細(xì)胞，收獲總蛋白，利用Protein A與目的蛋白IgG FC段特異性結(jié)合的性質(zhì)，免疫親和純化，快速獲取目的蛋白粗品。SDS—PAGE可見39KD左右的目的蛋白條帶。Western Blot結(jié)果證明該蛋白樣品可被抗REM—1抗體特異性識別，證明該蛋白為TREM—1融合蛋自。
　　 融合蛋白治療1組大鼠予以TREM—1/IgG融合蛋白

6、治療24小時后，與融合蛋白治療2組和生理鹽水組大鼠相比，血淀粉酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及C反應(yīng)蛋白水平有下降趨勢。融合蛋白治療1組大鼠的胰腺炎癥、出血、壞死的評分，較其它兩組，得到顯著改善(P<0．05、)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了TREM—1/IgG融合蛋白真核表達載體，并在Bm細(xì)胞中穩(wěn)定表達。融合蛋白TREM—1/IgG能有效緩解急性重癥胰腺炎大鼠的炎癥反應(yīng)，減輕胰腺損害，且主要是在重癥胰腺炎發(fā)病早期發(fā)揮重要作用，有效抑制炎性反應(yīng)的觸