小鼠TREM-1分子CDR1保守區(qū)的克隆、原核表達(dá)及純化.pdf

1、研究背景和目的： 膿毒癥具有較高的死亡率，嚴(yán)重危害人類健康。目前研究表明：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活單核/巨噬細(xì)胞引起的細(xì)胞因子過度釋放是臨床上膿毒癥的主要原因之一。LPS進(jìn)入體內(nèi)后主要是通過與脂多糖結(jié)合蛋白(LPS-bindingprotein，LBP)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，與分泌型蛋白MD-2、膜上的CD14、TLR4(Toll-likereceptor4)等分子結(jié)合，形成結(jié)合有LPS的受體復(fù)合

2、體，由TLR4胞內(nèi)段與MyD88結(jié)合啟動(dòng)LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終引起NF-kB的活化，引起促炎癥細(xì)胞因子的釋放，使得炎癥反應(yīng)放大。髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體-1(triggeringreceptorsexpressedonmyeloidcells-1,TREM-1)是新近發(fā)現(xiàn)的能放大炎癥反應(yīng)的又一重要分子，對LPS等細(xì)菌產(chǎn)物引發(fā)的急性炎癥發(fā)應(yīng)有顯著放大作用，該分子被認(rèn)為可能是拮抗膿毒癥的重要靶分子之一。 TREM-1分子選擇性表達(dá)于

3、中性粒細(xì)胞、CD14+單核/巨噬細(xì)胞表面，分子表面有三個(gè)抗體等效互補(bǔ)決定區(qū)(antibody-equivalentcomplementaritydeterminingregion，CDR)。該分子在體內(nèi)有兩種存在方式：膜結(jié)合型和可溶型，可溶型的TREM-1相當(dāng)于膜結(jié)合型的胞外區(qū)。膜結(jié)合型TREM-1的活化需要LPS和位于血小板上的未知配體協(xié)同作用，活化后能顯著上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、GM-CSF)和趨化因子

4、(IL-8、MCP-1)的持續(xù)分泌及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的釋放，引起中性粒細(xì)胞脫顆粒、呼吸暴發(fā)和吞噬反應(yīng)，并抑制抗炎因子IL-10的表達(dá)；而可溶型TREM-1的功能則是抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對敗血癥動(dòng)物模型有保護(hù)作用。TREM-1分子的氨基酸的保守性分析發(fā)現(xiàn)CDR1附近的氨基酸序列也較為保守，而該區(qū)域的功能目前還無報(bào)道，該區(qū)域是否參加了TREM-1分子與LPS或天然配體的作用目前尚不明確。因此本研究

5、擬通過原核表達(dá)得到小鼠TREM-1CDR1保守區(qū)融合蛋白，并進(jìn)行純化及相應(yīng)的初步鑒定，為研究該區(qū)域的功能奠定基礎(chǔ)。 主要技術(shù)方法： 從正常成年昆明小鼠組織中提取細(xì)胞基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出小鼠TREM-1分子CDR1保守區(qū)基因片段。構(gòu)建好PET-30a(+)-CDR1原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析和Weste

6、rnblot檢測分析鑒定。超聲碎菌法對目的融合蛋白進(jìn)行分離，并進(jìn)行親和層析純化，最后經(jīng)過透析復(fù)性獲得目的融合蛋白。 結(jié)果： 1.通過對小鼠TREM-1的同源性分析發(fā)現(xiàn)，CDR1附近較保守的氨基酸殘基主要位于羧基端的第31-56位，由DNAMAN軟件比對該區(qū)域的DNA和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)其位于同一外顯子，故以小鼠基因組DNA為模板，確定擴(kuò)增編碼18-63位的氨基酸的核苷酸序列。 2.采用PCR技術(shù)，以小鼠基因組DN

7、A為模板，擴(kuò)增得到了編碼小鼠TREM-1含CDR1的保守區(qū)的長176bp的基因序列，其中含限制性酶切位點(diǎn)、原核終止密碼子等。 3.將該基因序列與原核表達(dá)載體pET30a(+)雙酶切后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒，序列測定結(jié)果表明成功構(gòu)建了pET-30a(+)-CDR1表達(dá)載體。 4.構(gòu)建好的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)plysS，通過IPTG誘導(dǎo)陽性菌株進(jìn)行表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，確定了最適宜的表達(dá)

8、條件為30℃減慢誘導(dǎo)7h。電泳結(jié)果表明，重組陽性菌誘導(dǎo)后表達(dá)出約12kD大小的新生融合蛋白帶，與預(yù)期融合蛋白分子量相符。Westernblot鑒定結(jié)果顯示該蛋白與小鼠anti-His單克隆抗體有特異性結(jié)合能力。 5.應(yīng)用Qiagen公司的Ni-NTAagarose，經(jīng)pH梯度洗脫進(jìn)行含6×His標(biāo)簽融合蛋白的親和層析純化。經(jīng)含GSH/GSSH的透析液透析復(fù)性，獲得小鼠TREM-1含CDR1的保守區(qū)融合蛋白。 結(jié)論：