人胱抑素C可溶性表達(dá)、多克隆抗體制備及檢測方法的建立.pdf

1、胱抑素C(Cystatin C，CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一種非糖基化的堿性低分子量蛋白質(zhì)。該蛋白能夠在所有有核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，幾乎不受年齡、性別、體重、感染、飲食、體表面積等因素的影響。胱抑素C是迄今為止基本能夠滿足腎小球?yàn)V過率(GFR)理想內(nèi)源性標(biāo)志物要求的物質(zhì)，對于早期腎功能損傷的診斷和治療具有重要意義。其檢測方法主要是免疫學(xué)法，但目前國內(nèi)CysC診斷試劑及標(biāo)準(zhǔn)品主要由國外公司提供，價(jià)格昂貴，使病人和社會(huì)醫(yī)療成本較高

2、。因此，胱抑素C免疫診斷試劑盒的自主研發(fā)具有重要的價(jià)值和意義。
　　目的：
　　獲得Trx-CysC以及無蛋白標(biāo)簽的CysC兩種可溶性重組蛋白。用純化的無蛋白標(biāo)簽CysC重組蛋白制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。用Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔獲得CysC的多克隆抗體，建立CysC顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法(particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)并進(jìn)行初步方法學(xué)評(píng)價(jià)，為該方

3、法的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.在不改變氨基酸序列的前提下，對CysC的全長編碼基因進(jìn)行大腸桿菌同義密碼子偏好性優(yōu)化后人工合成其序列，并插入原核表達(dá)載體pET32a(+)，楗CysC優(yōu)化后的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-CysC。經(jīng)測序鑒定正確后，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白可溶性表達(dá)并純化獲得Trx-CysC。
　　2.從HL60細(xì)胞株提取總RNA，行RT-PC

4、R獲得cDNA模板，再經(jīng)高保真PCR獲得CysC的DNA片段。將該人CysC的全長編碼基因插入原核表達(dá)載體pCold TF，構(gòu)建CysC原核表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-CysC。待測序結(jié)果與預(yù)期相符后，將該重組質(zhì)粒pCold TF-CysC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)并純化獲得可溶性重組蛋白TF-CysC。利用GST-HRV3C蛋白酶切除該融合蛋白的TF標(biāo)簽，再經(jīng)分子篩去除TF標(biāo)簽、3C蛋白酶獲得無蛋白標(biāo)

5、簽的CysC，SDS-PAGE鑒定其純度。
　　3.用純化的重組蛋白Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔，經(jīng)蛋白A柱純化制備CysC多克隆抗體。
　　4.采用已純化的CysC多克隆抗體包被膠乳顆粒，建立檢測CysC的PETIA方法，并進(jìn)行初步方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)分子克隆和蛋白表達(dá)技術(shù)，獲得了可溶性表達(dá)的Trx-CysC。由于該重組蛋白帶有6×His標(biāo)簽，所以可通過鎳柱親和純化獲得高純度的重組

6、蛋白制品。以該蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得CysC的多克隆抗體。
　　2.經(jīng)分子克隆和蛋白表達(dá)技術(shù)，獲得了可溶性表達(dá)的TF-CysC，并通過鎳柱和分子篩兩步純化法成功獲得無蛋白標(biāo)簽、可作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的CysC。
　　3.用自制的CysC多克隆抗體包被膠乳顆粒，建立檢測CysC的PETIA方法，該方法與進(jìn)口商品化試劑盒具有良好的相關(guān)性，具有一定的應(yīng)用潛力和市場前景。
　　結(jié)論：
　　1.利用分子克隆和重組蛋白技術(shù)獲得