人可溶性CD14檢測體系的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、國內(nèi)關(guān)于sCD14的研究極少,究其原因,與目前尚無國產(chǎn)試劑盒而國外進口試劑盒價格昂貴有關(guān).為解決這一困難,推動該領(lǐng)域的研究,并為國內(nèi)關(guān)于CD14的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供技術(shù)支持,該研究建立了人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測體系;同時,還從人血漿中提取了天然sCD14,并進行了人CD14基因的克隆和表達,為在后續(xù)工作能深入研究CD14的生物學功能,探討CD14與Toll樣受體的相互作用以及在抗感染免疫中發(fā)揮的作用奠定了必要的基礎(chǔ).一

2、、建立人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測體系首先進行了抗人CD14單克隆抗體的純化和多克隆抗體的制備.利用己獲得的抗人CD14單抗和多抗建立人sCD14單多抗雙夾心ELISA檢測體系.通過優(yōu)化實驗條件,確定了單抗60bca包被濃度,兔抗人CD14多抗和HRP-羊抗兔IgG的工作濃度;用IBL公司進口人sCD14檢測試劑盒標定混合正常人血清,作為該檢測體系的標準品和質(zhì)控血清.該研究利用自行建立的sCD14檢測體系,測定了154名正常人

3、,137名神經(jīng)內(nèi)科住院患者以及300余名心內(nèi)科住院患者血清標本.經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):健康人群中不同年齡組血清sCD14水平有一定差異;腦梗塞患者血清sCD14水平顯著高于同年齡段正常對照組;急性冠脈綜合征(急性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛)患者血清sCD14水平也有顯著升高.以上研究為進一步探討sCD14在心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供了重要依據(jù).二、人可溶性CD14的提取與制備為獲得純化人CD14蛋白用于后續(xù)工作,我們利用免疫親和層

4、析技術(shù)從人血漿中提取天然sCD14蛋白.將純化的單抗60bca與CNBr-actived Sepharose 4B交聯(lián),制備了sCD14親和層析柱,從200ml人血漿中純化獲得400μg sCD14蛋白,經(jīng)Western Blot和商品ELISA試劑盒鑒定,其特異性較好,保持了天然蛋白的生物活性.我們的后續(xù)工作包括:(1)進一步推廣sCD14檢測體系在基礎(chǔ)研究與臨床中的應(yīng)用;(2)繼續(xù)探索獲得大量表達重組人CD14蛋白的實驗條件,并通過