牛可溶性CD14基因的克隆表達(dá)及對(duì)脂多糖毒性的保護(hù)作用的初步研究.pdf

1、乳房炎是奶牛場(chǎng)中三大常見(jiàn)疾病之一，其中大腸桿菌引起的乳房炎在臨床上較為普遍。大腸桿菌型乳房炎病例中80～90％表現(xiàn)為臨床性，10％發(fā)展為急性內(nèi)毒素性休克，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)死亡。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分。CD14是LPS的細(xì)胞表面分子受體，分為膜型CDl4(mCDl4)和可溶性CD14(sCDl4)兩類。mCDl4分布于單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面；sCDl4存在于血漿、尿液和奶汁中。對(duì)于LPS介導(dǎo)的細(xì)胞和信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)是通過(guò)

2、LPS、CD14和一種急性期蛋白LPS結(jié)合蛋白(LBP)三者相互作用來(lái)調(diào)節(jié)的。大量實(shí)驗(yàn)表明sCDl4與mCDl4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LPS，在調(diào)節(jié)由革蘭氏陰性菌引起的細(xì)菌感染和內(nèi)毒素性休克中起著重要作用。國(guó)外已有一些報(bào)道關(guān)于應(yīng)用重組牛可溶性CDl4(rbsCDl4)分子防治奶牛乳房炎，但國(guó)內(nèi)這方面的具體研究尚幾乎處于空白。 本研究從大腸桿菌型乳房炎的奶牛全血中分離白細(xì)胞，提取總RNA，合成cDNA。根據(jù)已發(fā)表的牛CDl4全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)

3、牛sCDl4特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因，將其克隆進(jìn)pMD18-T easy載體，經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序驗(yàn)證，擴(kuò)增出的牛sCDl4片段與預(yù)期大小相符(1026bp)。用EcoR I和Hind Ⅲ將該基因片段從pMDl8-T easy載體上切下，回收目的DNA片段，與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTa連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-sCDl4，轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid和輔助質(zhì)粒helper plasmid的

4、大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)后，通過(guò)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)移獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacmid-sCD14；通過(guò)脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，獲得攜帶牛sCDl4基因的重組桿狀病毒rBac-sCDl4。將rBac-sCDl4感染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9后，經(jīng)PCR鑒定pBacmid-sCDl4 DNA成功導(dǎo)進(jìn)Sf9細(xì)胞，通過(guò)Western blot證實(shí)重組牛sCDl4蛋白(rbsCDl4)在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)得到了表達(dá)。并進(jìn)一步通過(guò)金屬鏊合層析、透析、PE

5、G濃縮等方法純化濃縮該蛋白，最終獲得約1.1mg重組蛋白?；谏鲜鲅芯?，我們選取BALB/c雌鼠來(lái)制造乳房炎動(dòng)物模型以進(jìn)一步研究rbsCDl4的生物活性。為了研究rbsCDl4在體內(nèi)對(duì)于LPS的保護(hù)作用，把10只8周齡的BALB/c雌鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組腹腔注射LPS(8μg/g體重)、PBS，處理組腹腔注射LPS(8μg/g體重)、rbsCDl4(6μg/g體重)。注射后24h～48h內(nèi)對(duì)照組中5只小鼠全部死亡，而處理中5只小鼠3只

6、死亡。為了研究rbsCDl4對(duì)小鼠乳房炎的保護(hù)作用，對(duì)4只經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠第4對(duì)乳房注射25CFU的E.coli P4，同時(shí)，一側(cè)乳房注射rbsCDl4(6μg)，對(duì)側(cè)乳房注射PBS。與對(duì)照組相比，24h后可解剖觀察到rbsCDl4處理組乳房腫脹和出血癥狀減輕；通過(guò)細(xì)菌計(jì)數(shù)，可見(jiàn)rbsCDl4處理組細(xì)菌數(shù)顯著減少。上述試驗(yàn)結(jié)果表明：rbsCDl4蛋白在體內(nèi)具有一定的結(jié)合或中和LPS的生物活性，能減緩小鼠由大腸桿菌感染引發(fā)的乳房炎的嚴(yán)